[求救] clone不出來
2.8K這段我已經有成功接在pGEX上
但是要把他再接進去flag
卻一直接不出來 希望大家可以給我一點建議
我實驗的步驟在下面 希望大家可以幫我看看問題出在哪...
1) PCR
10X buffer 2.5
dNTPs 0.5
Primer-R 0.5
Primer-F 0.5
DNA polymerase(pfu)0.5
DMSO 1.5
ddH2O 18
->clean up->跑膠(跑起來是single band)
2) 切RE
buffer 3 5 ul buffer3 5ul
PCR product 15 ul flag(midi) 1ul
NotI 1.5 ul NotI 1.5ul
SalI-HF 1.5 ul SalI-HF 1.5ul
100X BSA 0.5 ul 100x BSA 0.5ul
ddH2O 26.5 ul ddH2O 40.5ul
作用37度，3小時 -> clean up ->跑電泳
3) ligation
vector 4 ul
DNA 8 ul
T4 ligase 1 ul
ATP 1 ul
buffer 2 ul
ddH2O 4 ul
4) Tansformation(DH5alpha):
on ice 30min
HEAT-SHOCK 42度 90sec
on ice 2min
LB培養 3hr
塗盤(LB agar Amp) O/N
(菌落都沒有長的很大，比較大的約只有0.1cm，大的很少，一盤大約只有10顆以內
很多超小的菌落，不太像衛星，因為是很均勻分布在整個盤子上，應該有幾百顆 )
5)colony PCR
很小的跟大顆的都有P，都沒有P到我要的東西，但是有P到很多條band
P.s有拿空的flag做transform，但是長出來的也是很小的菌落，滿滿的一盤
不知道是不是因為塗盤的時候下太多了?!
希望大家可以幫我指點迷津
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.47.66.228
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