[求救] clone不出來

看板Biotech作者jck0406 (jck)時間16年前 (2010/01/16 18:28)推噓2(2推 0噓 12→)

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最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見以下是我做clone的步驟 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp) DDW 36.5 10X buffer 5 dNTPs 4 Primer-R 1.5 Primer-F 1.5 DNA polymerase 0.5 94度 10分 94度 1分 58度 40秒 72度 2分 72度 8分重複30個cycle 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 http://ppt.cc/w7Oi 3) gel extraction 4) 切RE 10X buffer 6 ul DNA 52 ul BamHI 1.5 ul EcoRI 1.5 ul 作用37度，3小時 5) clean up後再跑電泳 http://ppt.cc/SXMh 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) vector 4 ul DNA 6 ul ligation kit 10 ul 7) clean up 8) Tansformation: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) http://ppt.cc/picw http://ppt.cc/yElL 9)之後我再挑菌，培養O/N 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND http://ppt.cc/rTvE http://ppt.cc/ztTE 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津 ------------------------------------------------------------ 另外我還想補充幾個問題： a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? 麻煩大家了，謝謝:D clone新手留 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.120.120.118

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aceliang

01/16 19:56, , 1^F

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jck0406

01/16 20:16, , 2^F

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foxrose

01/16 23:36, , 3^F

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