Re: [求救] clone不出來
以下是我的淺見 (供參考用 ^^")
※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言：
: 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
: 以下是我做clone的步驟
: 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)
: DDW 36.5
: 10X buffer 5
: dNTPs 4
: Primer-R 1.5
: Primer-F 1.5
: DNA polymerase 0.5
: 94度 10分
: 94度 1分
: 58度 40秒 →Annealing temp.是不是有跑過gradient找出最佳
搞不好在高一點,就不會那麼多band
: 72度 2分 →你只有1kb,就我用過的polymerase也不會跑到2min
Extension time過長容易有多個products
: 72度 8分
: 重複30個cycle
: 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
: clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
: http://ppt.cc/w7Oi
: 3) gel extraction →在這邊或許可以接個cloning vector定序確定一下再RE
覺得可以增加你DNA量及正確性
: 4) 切RE
: 10X buffer 6 ul
: DNA 52 ul
: BamHI 1.5 ul
: EcoRI 1.5 ul
: 作用37度，3小時
: 5) clean up後再跑電泳
: http://ppt.cc/SXMh
: 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
: vector 4 ul (→這邊相信你應該有算過Insert:Vector比例了)
: DNA 6 ul
: ligation kit 10 ul
: 7) clean up
: 8) Tansformation:
: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
: http://ppt.cc/picw
: http://ppt.cc/yElL
: 9)之後我再挑菌，培養O/N
: 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
: http://ppt.cc/rTvE
: http://ppt.cc/ztTE
: 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
: ------------------------------------------------------------
: 另外我還想補充幾個問題：
: a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
: 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
: b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
: 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
: 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
: c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
: 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
: d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功了
: 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
: 麻煩大家了，謝謝:D
: clone新手留
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◆ From: 140.112.84.225
推
01/17 12:18, , 1F
01/17 12:18, 1F
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