Re: [求救] clone不出來

看板Biotech作者sancra (Lab Pub Orz...)時間14年前 (2010/01/16 23:46)推噓5(5推 0噓 9→)

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※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言： : 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見 : 以下是我做clone的步驟 : 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 如果可以，dNTPs與primer濃度能不能寫一下還有可能是我比較龜毛，不過你的總體積加起來不到50... primer量太多，non-specific的機率也可能增加可能試試看改變一下濃度 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重複30個cycle 58度確定是最適溫度嗎，可以試著跑gradient 看看較高的Tm下，non-specific band能不能減低另外72度2分，對1kb來說好像真得太久了最後那個8分也很長然後我們老師之前告訴我們做實驗不要存僥倖心理所以在PCR condition還沒調到最好之前建議你之後的步驟都別在做了這種by chance的狀態下，就算真的成功也很難被認可一點小建議，請參考看看 : 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND : clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 : http://ppt.cc/w7Oi : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小時 : 5) clean up後再跑電泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培養O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津 : ------------------------------------------------------------ : 另外我還想補充幾個問題： : a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去 : 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ : b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說 : 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 : c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分， : 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 : d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功， : 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? : 麻煩大家了，謝謝:D : clone新手留 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 125.230.194.4

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saviora

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saviora

01/17 00:54, , 2^F

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推

jck0406

01/17 12:09, , 3^F

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