Re: [求救] clone不出來
有些地方我提供一點小小意見,供您參考^^
: 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
: clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
既然很多條band，要如何肯定在位置差不多的那條band是所要的產物？
如果不能確定，那即使做gel extraction也會挖到錯的DNA
: 3) gel extraction
: 4) 切RE
: 10X buffer 6 ul
: DNA 52 ul
: BamHI 1.5 ul
: EcoRI 1.5 ul
: 作用37度，3小時
: 5) clean up後再跑電泳
: http://ppt.cc/SXMh
因為你是兩種酵素同時作用，如果可以，確認一下在你的實驗時要條件下
兩個酵素同時作用時效力是可接受的
(我之前的經驗是,依照酵素說明書的建議，
選了一種可以使兩種酵素同時有75%作用的buffer，同時用兩種酵素做切割
但是事實告訴我說明書的建議有時候聽聽就好
因為使用它建議的buffer,酵素連75%的效力都達不到...
後來我就分兩次進行酵素切割了)
: 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
: vector 4 ul
: DNA 6 ul
: ligation kit 10 ul
: 7) clean up
: 8) Tansformation:
: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
: http://ppt.cc/picw
: http://ppt.cc/yElL
: 9)之後我再挑菌，培養O/N
: 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
這對primer會得到很多雜band，在一開始的結果就知道了，
所以在這個步驟看到很多雜band我也不覺得奇怪。
你要不要考慮用enzyme digestion的方式切看看，看能不能切出你接進去的insert。
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: 另外我還想補充幾個問題：
: a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
: 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
clean up有可能會降低ligation產物的量，如果transformation的效率又不好，
得到正確的colony的機會有可能變少
我自己作cloning是沒有作clean up，ligation產物就直接進行transformation
因為我的想法是ligation成功的產物就很少了,我不想要丟失任何的DNA
: b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
: 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
: 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
我切過酵素的DNA也都冰-20度C，且根據之前cloning高手的說法，
他冰的DNA過了很久很久之後都來可以用...所以我覺得這個因素影響可能不大
: c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
: 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
我之前用的vector是某cloning高手冰在-20度C三四年的產物，
我還是有接成功耶...所以...可能還好吧
: d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
: 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
你的vector可能會切不乾淨，而self-ligation成原來vector
那些vector就會使細菌漲出colony來，這個我不覺得很奇怪。
cloning的眉眉角角很多，試著一個一個釐清，多問多學，會從中得到很多經驗的，
希望我的想法對你有幫助，加油啦~^^
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◆ From: 211.76.175.139
※ 編輯: lail 來自: 211.76.175.139 (01/16 19:52)
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01/16 20:01, , 1F
01/16 20:01, 1F
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01/16 20:05, , 2F
01/16 20:05, 2F
你是指學姊的vector已經self ligation的意思嗎?
有人會在切完enzyme後作CIP，降低只切一刀的vector self-ligation的機會，
如果兩刀都切乾淨，理論上也應該無法self-ligation
因為不知道你的學姊切enzyme的步驟，所以我不敢說。
如果真的擔心，就自己切vector好了
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01/16 20:07, , 3F
01/16 20:07, 3F
如果primer專一，vector理論上是無法得到產物的
可是你的primer看起來專一性不怎麼好，
所以看到最後的結果band很多其實不會很意外
※ 編輯: lail 來自: 211.76.175.139 (01/16 20:26)
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01/16 20:24, , 4F
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01/17 12:13, , 5F
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