Re: [求救] clone不出來
※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言：
: 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
: 以下是我做clone的步驟
: 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)
: DDW 36.5
: 10X buffer 5
: dNTPs 4
: Primer-R 1.5
: Primer-F 1.5
: DNA polymerase 0.5
: 94度 10分
: 94度 1分
: 58度 40秒
: 72度 2分
: 72度 8分
: 重複30個cycle
使用的polymerase為何？
使用前請先看datasheet，他會有一般的pre-heat/denature/anneal/extention的建議值
有的1kb/1min，有的1kb/2min，有的1kb/15sec，這些都會影響產物
primer的Tm值多少，用這個才能推估你的anneal的溫度
另外，你上面的配方沒有提到template？
: 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
: clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
: http://ppt.cc/w7Oi
1kb的產物用2％太奢侈了，0.8％或者1％就夠了
clean up kit本來就不是純化單一條band的工具
他只是把「所有」的DNA都純化下來，請先瞭解手頭上的工具的作用
: 3) gel extraction
: 4) 切RE
: 10X buffer 6 ul
: DNA 52 ul
: BamHI 1.5 ul
: EcoRI 1.5 ul
: 作用37度，3小時
哪一牌的酵素？
不同酵素廠商作用時間建議不同
是否可以double digest也不同
（雖然這兩種都是很好切的酵素......）
反應的體積也需要考慮
60ul是一個很奇怪的數字，如果是我做的話
我寧願20ul做兩管
過去也曾經做50ul或者100ul一管
但是效果並不會跟20ul做一管，多做幾個重複一樣，只會更差
有可能跟管子中的碰撞頻率有關
: 5) clean up後再跑電泳
: http://ppt.cc/SXMh
: 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
: vector 4 ul
: DNA 6 ul
: ligation kit 10 ul
vector跟insert的molar ration？
: 7) clean up
這一步是否必要？
每次純化就是將你的DNA再減少一點
如果不是必要，盡可能減少純化步驟
: 8) Tansformation:
: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
: http://ppt.cc/picw
: http://ppt.cc/yElL
heat/cold shock完，可以試著加入1ml LB培養兩小時讓你的clone複製多一點
同時讓抗性基因表現，可能可以將bacground降低
: 9)之後我再挑菌，培養O/N
: 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
: http://ppt.cc/rTvE
: http://ppt.cc/ztTE
: 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
如果一開始的條件不是很專一
在這邊就不用期待看到專一產物
既然plasmid都抽了，用restrictio enzyme切也不是不好
: ------------------------------------------------------------
: 另外我還想補充幾個問題：
: a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
: 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
: b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
: 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
: 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
: c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
: 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
: d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
: 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
: 麻煩大家了，謝謝:D
: clone新手留
超過一星期的，最好重新再切一遍
過去放在-20的DNA大概過一個月還勉強可以用
但是如果是新手，建議全部自己一步一步做
plate上面有菌落，只是代表這一棵clony可以抗你的抗生素
可能是對的，可能是self-ligation
也可能是污染菌，抗生素不是萬能
如果要PCR的話，直接做colony PCR可以一次做一堆clone
只要你老闆不會火大就好了:P
加油囉～
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※ 編輯: milkpa 來自: 114.46.112.222 (01/16 23:33)
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