Re: [求救] clone不出來

看板Biotech作者uokoperfect (病態)時間16年前 (2010/01/23 12:53)推噓6(6推 0噓 4→)

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※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言： : 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見 : 以下是我做clone的步驟 : 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp) : DDW 36.5 : 10X buffer 5 : dNTPs 4 : Primer-R 1.5 : Primer-F 1.5 : DNA polymerase 0.5 : 94度 10分 : 94度 1分 : 58度 40秒 : 72度 2分 : 72度 8分 : 重複30個cycle : 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND : clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。 : http://ppt.cc/w7Oi : 3) gel extraction : 4) 切RE : 10X buffer 6 ul : DNA 52 ul : BamHI 1.5 ul : EcoRI 1.5 ul : 作用37度，3小時 : 5) clean up後再跑電泳 : http://ppt.cc/SXMh : 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high ) : vector 4 ul : DNA 6 ul : ligation kit 10 ul : 7) clean up : 8) Tansformation: : 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml) : http://ppt.cc/picw : http://ppt.cc/yElL : 9)之後我再挑菌，培養O/N : 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND : http://ppt.cc/rTvE : http://ppt.cc/ztTE : 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津 : ------------------------------------------------------------ : 另外我還想補充幾個問題： : a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去 : 最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？ : b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說 : 切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。 : 我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。 : c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分， : 冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。 : d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功， : 那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢? : 麻煩大家了，謝謝:D : clone新手留最近也在PCR 本來先試一般的taq 條件抓到以後條件轉到有proofreading的酵素怎麼p都很多band 而且忘記做cotrol 後來做control 發現 control也是很多band 後來抓到是buffer污染了我沒看到你pcr有做control組不知道你有沒有確定沒有污染假設你確定沒有污染的話.... 你應該是在pcr的時候把條件抓到有singleband 再往下做比較好還是primer要不要重新設計一下是不是專一性不夠如果真的都不是上述問題你要不要把切酵素的時間縮短然後分開切 ECOR I一小時做CLEAN UP 然後 XHO I 一小時 CLEAN UP ECOR I 頗強搞不好會亂切但理論上來說你有切STICKY END 在接上VECTOR 除了 VECTOR當初沒切到自己接回去其他的都要有ECORI 跟 XHO I的切位才能接上 VECTOR 我覺得污染的可能性頗高 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.9.200.42

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bluecsky

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