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討論串[求救] clone不出來
共 10 篇文章
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2.8K這段我已經有成功接在pGEX上. 但是要把他再接進去flag. 卻一直接不出來 希望大家可以給我一點建議. 我實驗的步驟在下面 希望大家可以幫我看看問題出在哪.... 1) PCR. 10X buffer 2.5. dNTPs 0.5. Primer-R 0.5. Primer-F 0.5.
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最近也在PCR. 本來先試一般的taq 條件抓到以後. 條件轉到有proofreading的酵素. 怎麼p都很多band 而且忘記做cotrol. 後來做control 發現 control也是很多band. 後來抓到 是buffer污染了. 我沒看到你pcr有做control組 不知道你有沒有確定
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回文補充一下~. 因為開頭覺得您目前使用的PCR的 primer及條件似乎目前沒辦法調整到最好. 所以感覺這方法作plasmid 確認可能會有些隱性的問題存在. (PCR : P不出來不代表基因確定不存在，可能是沒找到最佳化條件). 所以同時面對萬惡的PCR 及萬惡的 clone 方式時. 先拿抽出
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如果可以，dNTPs與primer濃度能不能寫一下. 還有可能是我比較龜毛，不過你的總體積加起來不到50.... primer量太多，non-specific的機率也可能增加. 可能試試看改變一下濃度. 58度確定是最適溫度嗎，可以試著跑gradient. 看看較高的Tm下，non-specific
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