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作者 ljii 在 PTT [ Biotech ] 看板的留言(推文), 共107則

限定看板：Biotech

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[求救] western會有黑暗星雲出現

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +5

作者: REIDO - 發表於 2015/09/22 20:03(8年前)

4^F推ljii: 1.transfer 沒密合或是膜和膠之間有東西 2. 手指摸到膜09/23 10:05

[求救] RNA level與protrin level結果不成正相關

[ Biotech ]38 留言, 推噓總分: +5

作者: lb00202549 - 發表於 2015/09/02 23:37(8年前)

8^F推ljii: 呃...這是常見到不能再常見的狀況了09/03 05:50

9^F→ljii: 照你的說法是RNA測不到, protein測的到. 所以可以從RNA leve09/03 05:51

10^F→ljii: l及protein level各去想. 各自有無數可能09/03 05:51

11^F→ljii: RNA level :RNA sample quality? primer melting curve?換09/03 05:52

12^F→ljii: 組primer?RNA有沒有被DNA 污染?搞不好RTPCR產物跑膠是一個09/03 05:53

13^F→ljii: smear09/03 05:53

14^F→ljii: protein level: 你確定你blot到的是那個protein嗎?別的lane09/03 05:53

15^F→ljii: 也blot的到?有positive control嗎?(確定有表達該protein的09/03 05:54

16^F→ljii: cell line)09/03 05:54

17^F→ljii: 另外你的"皆有表現"也講的很含糊, western出來是一個09/03 05:54

18^F→ljii: big fat band, 還是是好幾條然後剛好有一條命中你預期的分子09/03 05:55

19^F→ljii: 量你就覺得是有表達?表達量跟loading control比呢?09/03 05:55

20^F→ljii: 假如上面troubleshooting都作完了, 確實是RNA表達量很低09/03 05:56

21^F→ljii: 但protein量高, 那可能就是有別的gene在作這個protein或是09/03 05:57

22^F→ljii: 剛好作一個類似大小又類似epitope的fragment (抗體好不好也09/03 05:57

23^F→ljii: 有差).09/03 05:57

24^F→ljii: 最後加個不負責任的預測,因為你說你RNA的Ct很高, (高是多少?09/03 05:58

25^F→ljii: 35?38?) 我會猜是你根本就是primer不好,換幾個primer試試吧09/03 05:58

[討論] CDNA上生物標記

[ Biotech ]26 留言, 推噓總分: +2

作者: stevekevin10 - 發表於 2015/07/09 17:27(9年前)

13^F→ljii: ....你要不要先講清楚你打算怎麼作病人檢體去分析?那是沒07/10 07:38

14^F→ljii: 有"天然"CDNA的, 你可以抽total RNA後作microarray那就是07/10 07:39

15^F→ljii: 你所謂的cDNA分析, 不過這年頭RNA-seq更夯07/10 07:39

[方法] Bacterial artificial chromosome (BAC)

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +1

作者: shiningspark - 發表於 2015/02/02 20:56(9年前)

1^F推ljii: 標準是作DH10B沒錯, TOP10也可以, 我都用過, 都沒問題02/03 10:28

2^F→ljii: 我的BAC 150-200kb都有02/03 10:28

3^F→ljii: 不過我還不曉得DH5a 吃不下10kb, 因為我試過是可以的, 我的02/03 10:29

4^F→ljii: construct 30kb, 存在DH5a, 之後再prep也沒問題02/03 10:29

5^F→ljii: 我想只是效率問題吧, 而效率問題根本沒差, 成功有一個clone02/03 10:30

6^F→ljii: 吃進去, 就可以作stock, 無限放大了02/03 10:30

[求救] PCR negative control鬼打牆

[ Biotech ]11 留言, 推噓總分: +4

作者: jiuen217 - 發表於 2015/01/16 10:03(9年前)

9^F推ljii: 害我看到internal control就覺得是RT, 進來才發現不是...01/16 13:41

Re: [方法]請問WB的band要怎樣壓片讓他看起來比較圓?

[ Biotech ]39 留言, 推噓總分: +8

作者: t123401221 - 發表於 2015/01/07 10:26(9年前)

14^F推ljii: transfer伏特數好像高了點我習慣35V 90分或50V70分01/07 12:01

16^F→ljii: 另外要不就是你loading定量沒定好就是你膠有問題,不均勻01/07 12:02

20^F推ljii: 沒有SDS01/07 12:13

21^F→ljii: 不過這很難參考. transfer條件跟你的gel, membrane, transfe01/07 12:14

22^F→ljii: 系統有關, 不能一概而論, 要自己抓條件01/07 12:14

23^F→ljii: 100V以我們lab常用的gel通常就會過熱, 所以我猜你的gel跟我01/07 12:15

36^F推ljii: 記得剛學western時loading一直有問題. 後來發現煮完沒有spin01/12 09:55

37^F→ljii: down, 或是loading時太大力反濺出well, 這些都會影響01/12 09:57

[求救] 260/230 對qPCR的影響?

[ Biotech ]8 留言, 推噓總分: +5

作者: caesar0926 - 發表於 2014/10/09 13:40(9年前)

7^F推ljii: 應該是看情況, 我的經驗裡230影響不太大. 除非很難p的primer10/12 11:04

[討論] 同樣條件，PCR第二次卻P不出來!?

[ Biotech ]22 留言, 推噓總分: +5

作者: shunminhsu - 發表於 2014/10/04 09:47(9年前)

9^F推ljii: gDNA保存在TE還是水? 如果是水可能freeze thaw數次後就不穩10/06 09:22

10^F→ljii: 另外你product是多長啊? >10kb嗎? 你確定第一次p出來的是10/06 09:23

11^F→ljii: 產物還是nonspecific band? 10kb用普通Taq去p應該很難10/06 09:24

[求救] 如何確認長片段tandem repeat的數目

[ Biotech ]41 留言, 推噓總分: +7

作者: IDIDyan - 發表於 2014/05/26 23:47(10年前)

1^F推ljii:P不出來的是病人sample嗎? 有沒有試過用最短的repeat數05/28 13:46

2^F→ljii:當positive control, 至少確定primer可用?05/28 13:47

3^F→ljii:另外, tandem repeat的PCR本來就很困難, 有時連短短1kb都很難05/28 13:47

4^F→ljii:P, 何況你這是long PCR. 有沒有可能不要用long PCR硬幹?05/28 13:48

5^F→ljii:例如digest後跑膠看size? 檢體量不足不能作western但夠digest05/28 13:50

6^F→ljii:嗎?05/28 13:50

17^F推ljii:我有點誤解你的意思了, 你的sample是genomic DNA, 所以我的05/30 06:21

18^F→ljii:結論是最好的選擇是作southern. 你的probe可以選擇去anneal05/30 06:22

19^F→ljii:那段repeat, 因為你的repeat很多, 所以signal會超級亮. 所以05/30 06:22

20^F→ljii:你需要的genomic DNA量就不用那麼大, 1ug應該就夠了, 甚至更05/30 06:23

21^F→ljii:少都可能可以. 這跟detect single copy gene的southern動輒05/30 06:23

22^F→ljii:要好幾十ug的genomic DNA是不一樣的.05/30 06:23

23^F→ljii:另外Phusion對long PCR我覺得並不太優, 最強大的還是takara05/30 06:24

24^F→ljii:LA, 但是takara的proofreading感覺上沒有phusion佳.不過你沒05/30 06:25

25^F→ljii:差, 不需要非high fidelity不可.05/30 06:25

26^F推ljii:另外文獻裡有人有long PCR的protocol嗎? 還是你是自己設計05/30 06:28

27^F→ljii:primer在抓條件?05/30 06:29

34^F推ljii:嗯, 如果用廠商給的protocol, 遇到tandem repeat PCR, 往往05/31 14:20

35^F→ljii:就會遇到地雷. 我舉自身實例, 我研究的是某個triple nucleoti05/31 14:21

36^F→ljii:nucleotide repeat 疾病. 我們研究的這個病, 如果要PCR包含05/31 14:22

37^F→ljii:那段repeat的區域, 傳統Taq是死都p不出來的,即使片段只有1kb05/31 14:23

38^F→ljii:這個field用來PCR這段就是有固定的primer及polymerase, 大家05/31 14:24

39^F→ljii:都只用那幾種.改用別家的polymerase幾乎不可能work05/31 14:25

Re: [求救] 乾掉的EtBr是否有毒性？

[ Biotech ]63 留言, 推噓總分: +20

作者: ernie100ya - 發表於 2014/01/07 10:14(10年前)

15^F推ljii:我快被推文嚇死惹XDDDDDDDD01/07 14:11

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