[求救] 如何確認長片段tandem repeat的數目

看板Biotech作者 (我)時間10年前 (2014/05/26 23:47), 編輯推噓7(7推 0噓 34→)
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最近碰到的棘手問題懇請各位幫忙~~ 目標是 MUC4，這個 gene的 exon 2 主要是由連續的tandem repeat(48bp/TR)組成 之前文獻指出每個人的這段序列長度相差很大 (7k~19k都有) 我想知道的是""我們的病人和其他正常人的這段TR數目是否有差別"" 由於檢體量不多沒辦法做southern blot 之前嘗試用Long PCR的方式把整段TR P出來，可惜沒有band PCR condition 如下 TaKaRa LA Taq (5 units/μl) 0.5 μl 10X LA PCR Buffer ll (Mg2+free) 5 μl 25 mM MgCl2 (final 2.5 mM) 5 μl dNTP Mixture (final 400 μM each) 8 μl Template 500 ng Primer 1 1.0 μM (final conc.) Primer 2 1.0 μM (final conc.) ddH2O to 50 μl 92°C 2 min ↓ 92°C 10 sec------ 55°C 30 sec 10 cycles 68°C 15 min------ ↓ 98°C 10 sec--------------------- 55°C 30 sec 20 cycles 68°C 15 min + 15 sec/cycle------ ↓ 68°C 7 min 不知道能怎麼調整，或是有其他方法確認TR數目 請大家幫幫忙!拜託了!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 1.162.122.94 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1401119256.A.41E.html
推
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P不出來的是病人sample嗎? 有沒有試過用最短的repeat數
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當positive control, 至少確定primer可用?
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另外, tandem repeat的PCR本來就很困難, 有時連短短1kb都很難
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P, 何況你這是long PCR. 有沒有可能不要用long PCR硬幹?
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例如digest後跑膠看size? 檢體量不足不能作western但夠digest
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嗎?
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05/28 14:05, , 7F
我現在是先用正常人和cell line的sample先試
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由於無法確定每個人的repeat次數所以也不知道誰最短...
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05/28 14:07, , 9F
請問lj大先切看size的意思是什麼呢?我有試過用RE先把其他
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可能的nonspecific target切掉再PCR可惜還是沒有
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我也想知道有沒有其他步要用硬幹的方式哈哈....
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用phusion看看
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之前有問過phusion polymerase，最多能做到16k，可是文獻
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上寫這範圍可能有7k~20k...
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推
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南方點墨法QwQ 我家某TRmut小鼠這樣genotype
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檢體DNA沒那麼多啊ˊˋ
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推
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我有點誤解你的意思了, 你的sample是genomic DNA, 所以我的
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結論是最好的選擇是作southern. 你的probe可以選擇去anneal
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那段repeat, 因為你的repeat很多, 所以signal會超級亮. 所以
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你需要的genomic DNA量就不用那麼大, 1ug應該就夠了, 甚至更
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少都可能可以. 這跟detect single copy gene的southern動輒
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要好幾十ug的genomic DNA是不一樣的.
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另外Phusion對long PCR我覺得並不太優, 最強大的還是takara
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LA, 但是takara的proofreading感覺上沒有phusion佳.不過你沒
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差, 不需要非high fidelity不可.
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推
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另外文獻裡有人有long PCR的protocol嗎? 還是你是自己設計
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primer在抓條件?
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推
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同意ljii...TR用傳統南方是可行的..只是要買大膠台XD
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BTW 我家小鼠取尾巴gDNA...量其實很少 但也可以作
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推
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或是原PO試試用random primer跑Long PCR再作南方試試..說
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不定是可行的方法??(累一點而已)
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這麼想想似乎southern真的可行，感謝兩位!
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另外Long PCR 我是參考各廠商的condition自己調整的
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推
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嗯, 如果用廠商給的protocol, 遇到tandem repeat PCR, 往往
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就會遇到地雷. 我舉自身實例, 我研究的是某個triple nucleoti
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nucleotide repeat 疾病. 我們研究的這個病, 如果要PCR包含
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那段repeat的區域, 傳統Taq是死都p不出來的,即使片段只有1kb
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這個field用來PCR這段就是有固定的primer及polymerase, 大家
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都只用那幾種.改用別家的polymerase幾乎不可能work
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我看到前人對我這段repeat都是做southern
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所以PCR condition只能自己試 qq
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