Re: [方法]請問WB的band要怎樣壓片讓他看起來比較圓?

看板Biotech作者 (沉默玩具)時間9年前 (2015/01/07 10:26), 編輯推噓8(8推 0噓 31→)
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※ 引述《t123401221 (沉默玩具)》之銘言： : 請問各位先進 : 我要看大約38KDa的分子GAPDH : 跑12.5% SDS-PAGE 電壓80 V : 但transfer完膜染ponceau S都可以看到明顯的band : 接著就是接抗體1抗1:1000 o/n 二抗1:12000 室溫1小時 : 但是手洗壓片,壓個五分鐘 : 壓出來的band都很弱而且band都扁扁的 : 而且band跟band之間都沒有間距看起來好像都連在一起 : 可以麻煩各位幫我解決這個問題嗎?? : 謝謝各位^^ 各位,我第一次貼圖如有不對的地方敬請見諒唷^^ http://ppt.cc/lZdl 這是GAPDH 一抗1:1000 可以請各位幫我解決這問題嗎? 謝謝大家^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 163.15.175.113 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1420597561.A.B51.html
推
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感覺定量不太準確,而且用到1:1000還這麼淡.不是量太少
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01/07 11:25, , 2F
就是抗體太爛了,transfer membrance也有差
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01/07 11:50, , 3F
請問該怎麼改善定量問題阿?我的protein OD 595nm
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01/07 11:52, , 4F
測出來都差沒多少耶??
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各位transfer條件都是甚麼呢?我方法100V 1hr transfer
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如果地量差不多也有可能是loading的問題，看你loading
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buffer裡有SDS之後再換成30V 30min buffer 裡無SDS
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(定量) loading太多可能會從well跑掉
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我loading量都很少耶最多就9ul
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若是兩側的band較淡可能是transfer(濕式)時兩邊沒夾緊
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看起來band有點糊糊的，建議下膠製膠時凝久一點
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不然就是你的Tris buffer pH值跑掉了，要校正
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但我家助理跟我用一樣的條件RUN出來的就很正常
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推
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transfer伏特數好像高了點 我習慣35V 90分 或50V70分
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雖然我們兩個的細胞跟實驗都不同只有WB實驗條件一樣
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另外要不就是你loading定量沒定好就是你膠有問題,不均勻
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ljii 你的transfer裡有SDS嗎??
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推
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transfer 我都用400mv 90min.transfer buffer我習慣會加
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sds,可以幫助他更容易transfer過去
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沒有SDS
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不過這很難參考. transfer條件跟你的gel, membrane, transfe
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系統有關, 不能一概而論, 要自己抓條件
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100V以我們lab常用的gel通常就會過熱, 所以我猜你的gel跟我
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樓上用35V 90分 或50V70分很像semi-dry條件,與原po不同
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推
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對 我的是hofer系統,伏特高.所以我都會放冰箱
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定量, loading膠前必先vortex, spin down才不會吸不均勻
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或定錯量
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謝謝各位的指教！
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另外想請教各位有沒有推薦的method paper或是書可以
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讓我參考呢?謝謝各位^^
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推
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CURRENT PROTOCOL?
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請問roy047定量,loading膠前是先vortex還是spin down?
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sample先vortex確保混勻之後spin down 吸取
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因vortex完有些會在管壁上
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01/07 15:57, , 35F
因為如果不均勻, 吸的protein量就時多時少了, 會造成誤差
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推
01/12 09:55, , 36F
記得剛學western時loading一直有問題. 後來發現煮完沒有spin
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01/12 09:57, , 37F
down, 或是loading時太大力反濺出well, 這些都會影響
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推
01/12 12:26, , 38F
該不會是antibody搖不均勻的關係吧？
01/12 12:26, 38F
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01/13 01:07, , 39F
樓上……它濃度這麼高！很難哦！
01/13 01:07, 39F
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