[求救] RNA level與protrin level結果不成正相關

看板Biotech作者時間8年前 (2015/09/02 23:37), 8年前編輯推噓5(5推 0噓 33→)
留言38則, 10人參與, 最新討論串1/1
菜到不行的碩一新生的我最近剛跑完同一批cell line的QPCR以及western 結果發現在cancer cells中的RNA level所想看的x gene的CT值很高，幾乎沒有表現。 而western protein level的結果卻是皆有表現。 請問這種結果合乎邏輯嗎? 新手的我實在想不太到這兩者之間發生了什麼事(暫時排除人為技術><) 有稍微跟跟我一樣菜的同學討論了一下 同學說可能原因是: 1.RNA容易degrade，可能沒有測到。 2.有其他機制去影響x protein的表現。 再來還有什麼可能的原因呢? 謝謝!!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.243.117.119 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1441208245.A.9C2.html
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09/02 23:39, , 1F
這哪是相反了，有沒有適當的control怎麼是相反
09/02 23:39, 1F
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09/02 23:40, , 2F
不好意思!我用字不恰當><
09/02 23:40, 2F
※ 編輯: lb00202549 (111.243.117.119), 09/02/2015 23:40:53
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09/02 23:40, , 3F
你把現有抗體倍率再稀釋一千倍,WB結果不就跟QPCR一樣了阿
09/02 23:40, 3F
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09/02 23:42, , 4F
但是無論QPCR或是western的internal control都很清楚
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09/02 23:47, , 5F
等你用很多株細胞再來說WB與QPCR是不是一致
09/02 23:47, 5F
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09/02 23:49, , 6F
現階段的data把該抗體再多稀釋一千倍,WB就很QPCR一樣弱了
09/02 23:49, 6F
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09/03 00:09, , 7F
RNA quality OK嗎？
09/03 00:09, 7F
推
09/03 05:50, , 8F
呃...這是常見到不能再常見的狀況了
09/03 05:50, 8F
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09/03 05:51, , 9F
照你的說法是RNA測不到, protein測的到. 所以可以從RNA leve
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l及protein level各去想. 各自有無數可能
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09/03 05:52, , 11F
RNA level :RNA sample quality? primer melting curve?換
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09/03 05:53, , 12F
組primer?RNA有沒有被DNA 污染?搞不好RTPCR產物跑膠是一個
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smear
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protein level: 你確定你blot到的是那個protein嗎?別的lane
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也blot的到?有positive control嗎?(確定有表達該protein的
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cell line)
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另外你的"皆有表現"也講的很含糊, western出來是一個
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big fat band, 還是是好幾條然後剛好有一條命中你預期的分子
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量你就覺得是有表達?表達量跟loading control比呢?
09/03 05:55, 19F
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09/03 05:56, , 20F
假如上面troubleshooting都作完了, 確實是RNA表達量很低
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09/03 05:57, , 21F
但protein量高, 那可能就是有別的gene在作這個protein或是
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剛好作一個類似大小又類似epitope的fragment (抗體好不好也
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有差).
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最後加個不負責任的預測,因為你說你RNA的Ct很高, (高是多少?
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09/03 05:58, , 25F
35?38?) 我會猜是你根本就是primer不好,換幾個primer試試吧
09/03 05:58, 25F
推
09/03 10:17, , 26F
這好多原因，三言兩語也說不完...另外可能還有時間點的
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09/03 10:17, , 27F
問題哦..
09/03 10:17, 27F
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09/03 11:10, , 28F
請問時間點是什麼意思呢？
09/03 11:10, 28F
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09/03 20:55, , 29F
mRNA→protein這段時間也是要考慮的啊 也許你雖然測的到
09/03 20:55, 29F
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09/03 20:56, , 30F
protein 但mRNA早就degrade掉了啊 跟你一樣是小碩一 有
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09/03 20:56, , 31F
錯還麻煩指教一下
09/03 20:56, 31F
推
09/03 23:42, , 32F
先保證你的實驗condition是ok的再來考慮科學問題
09/03 23:42, 32F
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09/03 23:43, , 33F
RNA品質, primer/qPCR條件(是否有好的positive control)
09/03 23:43, 33F
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09/04 10:34, , 34F
probe 是自行設計的嗎？搞不好 probe 也有問題呢。
09/04 10:34, 34F
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09/04 10:36, , 35F
另外，你可以先看看你的mRNA，上面有没有早夭序列……
09/04 10:36, 35F
推
09/09 23:04, , 36F
蛋白如果在細胞裡面很穩定不容易降解 就算mRNA都消失
09/09 23:04, 36F
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09/09 23:05, , 37F
原本的蛋白質還是不會消失阿 就頂多沒有新生成更多
09/09 23:05, 37F
推
09/28 02:22, , 38F
primer換一組吧 或許根本沒抓到
09/28 02:22, 38F
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