[討論] 同樣條件，PCR第二次卻P不出來!?

看板Biotech作者 (sharkhsu)時間9年前 (2014/10/04 09:47), 9年前編輯推噓5(5推 0噓 17→)
留言22則, 10人參與, 最新討論串1/1
小弟PCR前有做過gradient測試，有成功找出最佳溫度。 因此在P產物時，就以此溫度下去P。第一次有成功，但不 曉得為什麼，第二、三次就P不出來了.. 儀器方面，溫度應該是沒問題。現在不曉得是不是因為temlpate 反覆凍融太多次，導致DNA(E.coli genomic DNA)都降解掉了.. template 濃度 : 0.84ng/μL (Taq 範圍是寫10pg-500ng) 濃度應該沒錯.. 只能請求各位前輩幫忙了.. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.123.126.146 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1412387273.A.B98.html
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10/04 12:28, , 1F
你不覺得你給的條件有點模糊嗎...?
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10/04 12:29, , 2F
pcr條件 sample怎麼萃的 儲存方式 凍融次數
10/04 12:29, 2F
sample是用kit抽的，平常和藥品(10X buffer,2mM dNTP, 50μM primer) 放在-20保 存。凍融的話，上星期大概開了3-4次.. PCR 條件: 95: 5min, 95: 1:00min, 55: 1min, 72: 10:00min 35cycle ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/04/2014 12:50:24
推
10/04 14:05, , 3F
我覺得你的cycle設計的怪怪的 72度10分鐘x35cycle?
10/04 14:05, 3F
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10/04 21:46, , 4F
product很長吧，所以elongation時間長
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10/04 23:17, , 5F
如果是product很長 一般Taq撐不了那麼久吧!?
10/04 23:17, 5F
推
10/05 00:26, , 6F
E.coli genomic DNA有這麼容易降解嗎@@
10/05 00:26, 6F
推
10/05 02:56, , 7F
phusion 1K/15sec 這酵素哪家的要作到10分鐘 我絕不買
10/05 02:56, 7F
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10/05 18:36, , 8F
genomic DNA應該是怕斷裂吧
10/05 18:36, 8F
推
10/06 09:22, , 9F
gDNA保存在TE還是水? 如果是水可能freeze thaw數次後就不穩
10/06 09:22, 9F
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10/06 09:23, , 10F
另外你product是多長啊? >10kb嗎? 你確定第一次p出來的是
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10/06 09:24, , 11F
產物還是nonspecific band? 10kb用普通Taq去p應該很難
10/06 09:24, 11F
我是保存在水裡面，真的就怕回融數次後壞掉。 另外產物約為2kb，而72度設定10分鐘的話， 是照說明書下去設定的。現在感覺變數很多，不太敢亂調整.. ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 12:07:54
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10/06 14:06, , 12F
你的cycle會不會是95:1min 55:1min 72:1min ? 最後才
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72:10 min做extension?
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阿..少打一項! 確實是先72: 1.5min 再 72: 10min ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 14:15:19
推
10/08 19:01, , 14F
不覺得這樣凍融次數就會降解...不然你可以再萃一次看看
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10/08 19:02, , 15F
我也發生過第一次可以P出來，但之後怎麼試就是不行..或許
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其實錯的是第一次....假設所有材料都確定OK，那就只好換
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primer了
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呃..其實當時候有三瓶tempalte，第一瓶用了約4-5次後就P不出來。第二瓶大概2-3次，第三 瓶一次都P不出... ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/09/2014 10:26:10
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之前實驗室有遇過類似的問題，以前都做得出來的 PCR 突
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然就都做不出來了，除錯除很久後發現是 primer 的問題
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，似乎是該 primer 序列很容易造成降解，重新設計後問
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10/10 10:58, , 21F
題就解決了。
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序列機率感覺不大 .. 因為有兩組primer再P不同產物..但都P不出來 有點冏 ※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/13/2014 15:33:44
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09/20 08:08, , 22F
gradian PCR依原本的條件再跑一次,樣品放在P出來的位置
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