Re: [求救] DNA電泳
※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言:
: 標題: Re: [求救] DNA電泳
: 時間: Wed Jul 22 00:06:07 2009
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: ※ 引述《yashi (我要天天快樂快樂)》之銘言:
: : 我是把real-time PCR做完的產物拿來跑電泳
: : 取15μL的sample加上3μl的dye
: : 這次跑出來的sample是β-actin 大小大概是60bp
: : PCR跑了40個cycle
: : 膠片是1%的agrose gel
: : buffer都是1× TBE buffer
: : 我之前也是照著這個條件跑
: : 都有跑出結果來
: : 不過最近幾次發現sample都卡在上面下不來…
: : 但是marker卻分得滿漂亮的
: : 現在根本不知道問題出在哪裡
: : 覺得很苦惱…
: : 希望板上有高手可以幫我解決
: : 感激不盡!!!
: : http://www.wretch.cc/album/show.php?i=yashihuang&b=17&f=1299448889&p=3
: 先謝謝很多人願意幫我一起釐清問題
: 其實我個人比較傾向是buffer或是sample的問題哎
: 因為我這個實驗重覆滿多次了
: 條件都是一樣的 1%的膠100V跑40min
: 不過之前都沒有這方面的問題
: 而且這次的sample是real-time完的產物
: 而我同時也有跑melting curve
: melting是一個很漂亮的peak
: 我p完的產物放在-20℃冰箱三天我就跑了
: PCR的program也不太可能有人動到…
: 因為我們實驗室就只有我瘋狂的在跑real-time PCR
: agrose我也都用一樣的
: 附帶一題
: 我的這個照片是用 切膠片用的光箱+數位相機+濾鏡照出來的
: 所以可能照片跟照膠器照出來的 品質會差很多0rz...
: 還有我不太了解 所謂的well裡面卡住的是template DNA是什麼意思…??
: 是代表我的template DNA加太多 所以反應不完全嗎?
: 如果是這樣的話可以從real-time PCR的curve或是melting curve看出來嗎?
: (我覺得如果template DNA很多的話 melting curve應該會很醜吧???)
: 最後 謝謝大家努力幫我解決!!
:
: --
: ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
: ◆ From: 61.229.148.140
: 推 seal0413:If your buffer has problem, your marker won't be 07/22 05:45
: → seal0413:showed clear. 07/22 05:49
: → seal0413:Maybe you should check your PCR reagent 07/22 06:11
: → seal0413:If PCR is ok, you will try real-time PCR!!! 07/22 06:13
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有點不了解s大說的意思 因為我的系統就是real-time PCR
只是老師想再跑膠而check size
: → bobbygau:經過Melting curve後,dsDNA全被打開,很短時間內降溫, 07/22 11:06
: → bobbygau:常常會亂黏而造成smear。我覺得可以不用跑膠了,不然就 07/22 11:08
: 真的假的…………
ps我們老師一直逼我
→ bobbygau:別做melting curve。SYBR Safe/Green染小片段效果不佳, 07/22 11:09
: → bobbygau:試試EtBr。 07/22 11:10
??? 聽不太懂b大的意思哎???
我跑膠的染劑是用Genomics公司出的HealthView Nucleic Stain
它號稱可以替代EtBr......
但比較不毒....
謝謝大家
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.23.86
→
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5年前
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