Re: [求救] colony PCR有P到 但定序無結果
colony PCR check 有結果，最後amplify出來的plasmid不對
最常見的原因就是部份或不完整的的ligation product
混在最後的transformation solution 中一起被塗在agar plate上
然後被敏感度很高的PCR 偵測到
但其實不是你的colony中真正maintain 的plasmid
另一個原因就是在用PCR amplify 你的insert的時候
放入過多的template，即使PCR product 經過了
elution、EZ digenstion、elution、ligation.....
後仍然殘留一些環狀template，因而進入形成colony，或殘留在agar上
也會造成PCR 能偵測到甚至最後被amplify-purify出來
要改善這些情況，可以在transforamtion - recovery in LB 37度 1hr之後
把收集到的菌 wash - spin down 兩次，就能清除大部分菌外DNA
另外PCR condition如果沒問題的話，實在不需要放太多template
通常1 ng就夠了，放越多污染越多
不然就是拿1 or 0.5 ul PCR product 當成template 再P 一次
就能得到雜質更少的PCR product（不過一般PCR 實在沒必要這麼麻煩）
另外有一種很罕見的情況就是一個colony 同時擁有兩種plasmid
我遇到是因為作一個40k 的clone，而background 是16k 的
這兩個的複製速度都太慢了（colony 當然也長很慢）所以可以並存
amplify 之後40k 的那個卻失去競爭力，再也抓不回來
只能存在於PCR 的證據中... （所幸後來還是有成功得到）
不過這種case，我大概也不會（也不想）再遇到下一次了.... ##
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