Re: [求救] colony PCR有P到 但定序無結果
1. 你挑的是藍的還是白的?.
白的
2. 你的insert 的來源是那裡?.
放在 yT&A vector 中的某個基因 我要在他兩端加上切位 所以抽plamid 做模板去p
3. 放個沒有transform 的 E.coli 再 PCR 一次看看
順便做一個只放空vector (沒有菌) 與你的primer 再做一次
以上簡單兩個control就能回答你問題
嗯我會試試看
我想請問一下沒有 transform 的 E.coli 哪來的阿 它不會長在 LBA 上 所以用 LB 養嗎?
這個步驟是為了確認是不是 P 到 chromosome 嗎?
4. colony PCR 用 vector 本身的 primer 來 amplify 比較不易出錯
其實我做了非常非常多測試 我簡單說一下流程好了
我做了兩次用自己 pirmer 做 pcr 確認 但定序都沒有
所以接下來
1.我一端用M13 一段用 isert 的 primer 做 pcr 有 p 到的送定序
此步驟我有挑藍色 colony 做 negative control "結果有band 但非預計片段大小"
我不知道怎麼解釋 就不管它.....
2.定序結果還是沒有..所以我抽送定序的菌的 plasmid 然後我用自己的 primer 去 p
plasmid 有預計大小的片段(所以我猜我之前 p 到的應該的確是 plasmid 上的序列)
然後我用re切一刀 (用 vector上只有一個切位 insert 沒有切位的re)
發現切完的片段和沒有轉進任何片段的 vector 是一樣長的
所以表示我沒有 insert 進任何東西
3.因此我此時懷疑是我 p 到了 vector 上的其他序列 所以我才會換 cloning 的 system
我很蠢 我不知道要怎麼看 primer 和 vector 的序列有無互補
因為可能只有一小段互補 我也不知道是哪一段阿?
4.我最後一次定序 就是用兩端 M13 做 colony PCR 結果一樣非常詭異
有 p 到兩種片段 一種是預計大小的(快1000bp) 但是非常非常淡
另一種很粗很亮 但是不是預計大小的片段 比較小一點(600bp)
比我的insert(850bp)還小 但是又不到沒有 insert 那麼小 (200bp)
我把有 p 到 1000bp 的送定序 恩 還是空的
然後我把用M13 P到兩種不同片段的菌再用 insert 的 primer p一次
然後通通都有 850bp 的片段
所以我現在正在抽 plasmid 我把 p 到兩種片段的菌都抽 plamsmid 明天要來切啦
恩 這就是我現在做的事 不好意思麻煩大家阿 我也想要趕快解決它 ~~
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◆ From: 218.167.21.22
※ 編輯: pan7353 來自: 218.167.21.22 (04/05 21:12)
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