Re: [求救] colony PCR有P到 但定序無結果
※ 引述《skylawer.bbs@ptt.cc (skylawer)》之銘言：
> ───────────────────────────────────────
> ※ 引述《pan7353 (要變成自己喜歡的模樣)》之銘言：
> : 不好意思 這個問題我其實已經問過一次了 但是還是沒有解決
> : 我的 insert DNA 有 846bp(PCR 得到的)
> : 放到 yT&A 的 TA cloning vector 中(用 TA clone 接)
> : 藍白篩選了六個 colony 做 PCR 結果都有 specific 的片段(用insert DNA的primer P)
> : 挑了四個 colony 送定序後 結果四個都沒有 insert DNA 的序列
> : (用 vector 上的 M13 定序)
> : 甚至連當初做 colony PCR 的 primer 序列都沒有
> : 我已經試過的方法
> : 1.換 pGEMT system 其他一樣 無效(因為我懷疑 colony PCR P 到 vector 上其他序列)
> : 2.定序結果我有試過互補和反轉的序列了 都一樣 定序結果只有 vector 序列
> : 3.直接抽 plasmid 用RE切 結果顯示沒有插入任何片段
> : 4.把當初 PCR 得到的 insert 片段直接送定序 結果是正確的序列
> : 5.另外 我們實驗室有三個人做 cloning 都發生一樣的情況 就是 colony PCR 有 band
> : 但定序回來都只剩下 vector 序列
> : 抱歉 問題有點長 其實我的重點就是 為何colony PCR 可 P 到 定序卻無結果?> : 那麼 colony PCR 究竟 P 到了什麼東西勒?
> 1. 你挑的是藍的還是白的?.
> 2. 你的insert 的來源是那裡?.
> 3. 放個沒有transform 的 E.coli 再 PCR 一次看看
> 順便做一個只放空vector (沒有菌) 與你的primer 再做一次
> 以上簡單兩個control就能回答你問題
> 4. colony PCR 用 vector 本身的 primer 來 amplify 比較不易出錯
s大大的control很有趣
是個好辦法
但我滿好奇的
為何不抽質體然後切割確認
而要以pcr方式
單純想知道為什麼而已
--
如果美麗必須成為過去
別忘了臨走時
請將記憶裝入行囊
順便關上曾經為你而開的窗
--
╭─ Origin ─╗ 新綠園 bbs.sa.ncyu.edu.tw ～ κλμ ─┤
├ Author ╡ 098063.CAGR.ncyu.edu.tw
→
04/05 20:38, , 1F
04/05 20:38, 1F
討論串 (同標題文章)
以下文章回應了本文：
完整討論串 (本文為第 3 之 9 篇)：