Re: [求救] colony PCR有P到 但定序無結果
※ 引述《pan7353 (要變成自己喜歡的模樣)》之銘言：
: 不好意思 這個問題我其實已經問過一次了 但是還是沒有解決
: 我的 insert DNA 有 846bp(PCR 得到的)
: 放到 yT&A 的 TA cloning vector 中(用 TA clone 接)
: 藍白篩選了六個 colony 做 PCR 結果都有 specific 的片段(用insert DNA的primer P)
: 挑了四個 colony 送定序後 結果四個都沒有 insert DNA 的序列
: (用 vector 上的 M13 定序)
: 甚至連當初做 colony PCR 的 primer 序列都沒有
: 我已經試過的方法
: 1.換 pGEMT system 其他一樣 無效(因為我懷疑 colony PCR P 到 vector 上其他序列)
: 2.定序結果我有試過互補和反轉的序列了 都一樣 定序結果只有 vector 序列
: 3.直接抽 plasmid 用RE切 結果顯示沒有插入任何片段
: 4.把當初 PCR 得到的 insert 片段直接送定序 結果是正確的序列
: 5.另外 我們實驗室有三個人做 cloning 都發生一樣的情況 就是 colony PCR 有 band
: 但定序回來都只剩下 vector 序列
: 抱歉 問題有點長 其實我的重點就是 為何colony PCR 可 P 到 定序卻無結果?
: 那麼 colony PCR 究竟 P 到了什麼東西勒?
1. 你挑的是藍的還是白的?.
2. 你的insert 的來源是那裡?.
3. 放個沒有transform 的 E.coli 再 PCR 一次看看
順便做一個只放空vector (沒有菌) 與你的primer 再做一次
以上簡單兩個control就能回答你問題
4. colony PCR 用 vector 本身的 primer 來 amplify 比較不易出錯
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