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作者 veltine 在 PTT 全部看板的留言(推文), 共60則

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[求救] Vector only 的 control 比 vector + i …

[ Biotech ]55 留言, 推噓總分: +12

作者: boblu - 發表於 2010/08/06 22:34(15年前)

42^F推veltine:100%這個數字在生物學上行不太通，就好像一開始碰cloning08/08 16:52

43^F→veltine:一直以為enzyme在它喜歡的buffer裡，就會有100% activity08/08 16:54

44^F→veltine:其實不然，雖然做double digestion但是難保vector同時被08/08 16:56

45^F→veltine:兩種enzyme切到；以你的問題為例，說不是你的vector只被切08/08 16:59

46^F→veltine:一刀，vector只留一個cutting site，ligation時…insert08/08 17:00

47^F→veltine:只有一邊被接上，造成你的vector only的plate長很多…08/08 17:02

48^F→veltine:vector+insert的plate長很少，當然這只是推測…Orz08/08 17:03

49^F→veltine:建議確認vector上的MCS沒有壞，用EcoRI及另距離一很遠的08/08 17:06

50^F→veltine:enzyme切切看，sequencing也是可以確認但有時不怎對...Orz08/08 17:07

[求救] 請問抽DNA最後加水或是TE液要怎麼回溶

[ Biotech ]18 留言, 推噓總分: +8

作者: schmitt - 發表於 2008/09/28 15:39(17年前)

6^F推veltine:我抽完大量之後的plasmid，用TE溶之後都給它大力的vortex09/28 21:14

7^F→veltine:之後放在4℃，一個月之後拿出來再vortex，轉到細胞上還是09/28 21:15

8^F→veltine:有螢光，不過genomic DNA要是vortex，嗯嗯…就再重抽一次09/28 21:16

9^F→veltine:吧…Orz…我的經驗不負責任的供你參考…09/28 21:17

Re: [討論] 電轉使用

[ Biotech ]22 留言, 推噓總分: +8

作者: lainhat - 發表於 2008/09/21 22:36(17年前)

2^F推veltine:製造上多利用燻硫及氧化作用，以達殺菌、漂白及去蟲的效果09/21 22:40

3^F→veltine:經該步驟處理後，必須立即煮沸，以去除殘留之硫。09/21 22:40

4^F→veltine:我是用滅菌過的…但是別把牙籤丟進LB裡，沾一下LB就好…09/21 22:41

5^F→veltine:每次都養的到菌…供你參考09/21 22:42

8^F推veltine:再養不出來的話…用tip挑菌養看看…09/21 22:45

9^F→veltine:不然就是你的抗生素濃度太高…殺光光…09/21 22:46

12^F推veltine:都試試吧…用牙籤和tip及換個人養看看…Orz09/21 22:50

Re: [求救]利用共軛顯微鏡觀察細胞內鈣離子的實驗方法

[ Biotech ]7 留言, 推噓總分: +2

作者: veltine - 發表於 2008/09/16 15:05(17年前)

3^F→veltine:這是我三年前做的實驗…protocol就是你打的那樣子…09/16 16:03

4^F→veltine:sorry...我也沒寫下來…全是依照data sheet上做的…09/16 16:04

6^F→veltine:抱歉我搞錯了…fluo-4也是Pluronic溶的，Probenecid是另09/16 17:11

7^F→veltine:一種kit…09/16 17:11

[方法] ligation的問題...

[ Biotech ]7 留言, 推噓總分: +5

作者: dreamysky - 發表於 2008/09/13 16:24(17年前)

4^F推veltine:看看ligation buffer有沒有沉澱…另外加ATP試試看…09/13 17:21

[求救]請問10公分的dish可以加多少lysis buffer下去刮呢?

[ Biotech ]40 留言, 推噓總分: +11

作者: vita221 - 發表於 2008/08/29 16:37(17年前)

1^F推veltine:以我的經驗而言，time course一到，就會把dish放在冰上，08/29 16:41

2^F→veltine:吸掉medium，用PBS wash兩次，之後再加入30-50μl的lysis08/29 16:42

3^F→veltine:buffer，而我用的dish是35mm的…細胞數有點忘了，但是夠跑08/29 16:44

4^F→veltine:WB至少兩次(一次20μg)…08/29 16:45

5^F→veltine:但是你先用PBS刮下細胞離心後再加lysis buffer…有可能在08/29 16:46

6^F→veltine:你刮下細胞的同時就把細胞給打破了，而protein跑到PBS，08/29 16:48

7^F→veltine:這樣子的話測出來的濃度就很少了，或者是你的treatment會08/29 16:48

8^F→veltine:會使細胞死亡，protein的量也會減少…08/29 16:49

9^F→veltine:事實上，在你用PBS wash細胞，再吸掉的同時，不會完全的吸08/29 16:51

10^F→veltine:PBS，所以當你再加入lysis buffer的量，就要考慮一下了…08/29 16:52

13^F推veltine:呵呵…不過前實驗室的做法是這樣…也跑的出來…08/29 17:20

15^F→veltine:所以…我想這是結果論吧…假如能成功完成實驗…就是好方法08/29 17:21

17^F→veltine:考量殘餘PBS來斟酌lysis buffer，是指10mm dish殘留量會高08/29 17:22

19^F→veltine:些，所以要protein濃度高一些相對體積要少一些…08/29 17:23

21^F→veltine:不擔心濃度不對？跑之前不是會測濃度嗎？不太懂這個疑問…08/29 17:24

27^F推veltine:所以這就是實驗啦~~黑貓白貓能捉到老鼠的就是好貓~~呵呵08/29 17:38

[求救] 請問降低背景螢光的固定方法

[ Biotech ]17 留言, 推噓總分: +3

作者: catalyst - 發表於 2008/08/29 05:10(17年前)

1^F推veltine:不知道你有沒有用雙染，看看另外的蛋白螢光是不是背景很強08/29 05:47

2^F→veltine:假如沒有的話，代表抗體專一性不好，用ED-1或是OX-42也可08/29 05:48

3^F→veltine:以染到reactive microglia/macrophage…08/29 05:49

4^F→veltine:假如兩種螢光背景都很強的話，考慮一下blocking時間久一些08/29 05:51

5^F→veltine:以上…僅供參考…Orz08/29 05:52

9^F推veltine:sorry...現在我才知道B4-isolectin不是抗體…Orz08/29 14:43

10^F→veltine:你提到的是組織自發螢光…想到我以前用的玻片（乾淨）也會08/29 14:44

11^F→veltine:自發螢光…所以上網請用google…打入tissue autofluoresce08/29 14:45

12^F→veltine:會有一些解決的方法…以上…僅供參考…Orz08/29 14:46

[求救] Gel Extraction Kit放了六年會過期嗎? @@

[ Biotech ]6 留言, 推噓總分: +2

作者: pocheng0227 - 發表於 2008/08/28 23:13(17年前)

1^F推veltine:德國製造品質保證…Orz，直接試試看，做完一個reaction08/28 23:27

2^F→veltine:不用半小時，再測測elute出來濃度如何？08/28 23:27

3^F→veltine:哎…分生的東西很多都沒寫有效期限，不過fermentas的08/28 23:29

4^F→veltine:enzyme 居然有寫有效期限…08/28 23:29

Re: [求救] 分段cloning

[ Biotech ]4 留言, 推噓總分: +2

作者: veltine - 發表於 2008/08/28 16:07(17年前)

2^F→veltine:在self-dimer…會有五個bp相連在一起…primer全長33mer08/28 22:36

3^F→veltine:在hairpin、self-dimer、heterodimer程度很輕微…08/28 22:37

[求救] 有關離心轉速rpm和X g..

[ Biotech ]9 留言, 推噓總分: +7

作者: mindy7794 - 發表於 2008/08/21 14:37(17年前)

4^F推veltine:RCF = 1.12 x Radius x (rpm/1000)^208/21 17:44

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