Re: [求救] 分段cloning
※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言：
: 已經卡很久的cloning…Orz
: 小弟正在clone一個3.5kb的轉錄因子…
: 由於primer專一性不夠高，所以想分段clone…
: 之後再接起來…因為沒有分段clone再接起來的經驗…
: 所以請問大家…
: Q1：整個序列為3.5kb，要把它拆成多大進行clone呢？
: 如1.7kb和1.8kb兩段或是1kb、1kb、1.5kb…
: Q2：PCR之後，直接切PCR產物，之後liagation，再
: subclone到我的vector上，還是先接上某一個
: 片段到vector上，再接另一個片段？請問那一種
: 方法比較好？
: 感謝大家…
3.5kb說大不大、說小也不小…
這個gene在我手上就是clone不出來…Orz
提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer
(含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast
到genomic DNA，但是我的total RNA已經用DNase I處理過，PCR
出來還是有很band…而且在1kb的位置特別亮…
想問的問題是要怎麼提高我的primer專一性，長度夠、GC%也正常
在47和50%、Tm為72和76…還有那個地方要注意的嗎？
另外，我的第二個問題，為什麼會這麼問，是因為牽涉到primer設
計上考量，假如是先接好我要的gene，這樣子primer酵素切位的設
計上，就簡單多了，問題是non-circular的片段可以用ligase接起
來嗎？
假如先接上某一片段，primer酵素切位的設計上就很傷腦筋了…
由於我用的vector是自己做的，切位由5'開始，只有NheI、PacI
、PmeI和NsiI可以用…
舉列來說：
NheI---1.7kb---NsiI
NisI---1.8kb---NsiI
先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不過還要再check是正
接還是反接…Orz
我想到的分段接的primer酵素切位只有這個，還有其它的方法嗎？
話說回來，有個gene約1.5kb，primer Tm為72和82，我用52℃就
可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的實驗…Orz
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