[求救] Vector only 的 control 比 vector + i …

看板Biotech作者 (六百)時間14年前 (2010/08/06 22:34), 編輯推噓12(12推 0噓 43→)
留言55則, 13人參與, 最新討論串1/9 (看更多)
囧 cloning 真的不是我的強項 囧 手上有一個片段 (8xx bp) 已經以 TA cloning 放到 vector 裡面 要轉到另外一個 expression vector (pCS2+, 兩生類與魚類用的, 3xxx bp） TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆為唯一）夾在中間 expression vector 上的 MCS 當然也是有這兩個 site pCS2+ 跟 TA construct 同時作 double digest 以後 pCS2+ CIP 一小時（double digest 應該沒必要 CIP？想說有作有安心） 在 gel 上有看到 insert 被 release 出來 --> pCS2+ 的 double digest 應該也是成功的吧？ gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫爾比大約3:1）作 ligation control 就是用水代替 insert 用的是 Takara 的 kit 2.1 O/N 以後取一半的 ligation product 丟 Invitrogen 的 competent cell 結果： vector only 的那一組長得比有 insert 的還多 囧 這種事發生不只一次了 實在已經想不出還漏了什麼？ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 131.212.202.90
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08/07 00:43, , 1F
有沒有接上才是重點吧@@
08/07 00:43, 1F
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08/07 01:20, , 2F
1.兩者都有star activity 2.買新的CIP 3.換成SAP
08/07 01:20, 2F
1. NEB 書上的說法是說在我用的反應條件下不會有可偵測的 star activity 切完跑 gel 看起來也是沒有明顯的 star activity 又而且 vector only 也是用 double digest 過的啊
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08/07 01:28, , 3F
會不會是competent cell的問題？(機率很低啦我知道)
08/07 01:28, 3F
用過兩批批號不同的 comptetent cell 加上自製的
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08/07 02:25, , 4F
長得比 control 少 根據過去的經驗有接上的機率低過百分之一
08/07 02:25, 4F
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08/07 02:25, , 5F
另外這個 vector 沒辦法作藍白篩選
08/07 02:25, 5F
有沒有可能只是作 gel extraction 切膠的時候還是帶到了 circular form 的 vector 因為跑膠的時候 band shift 的幅度沒有很大 只是這樣可以解是 vector only 為什麼長很多 卻無法解釋為什麼加了 inser 會變少啊？ （影響 circular form 被吃進去的比例？） ※ 編輯: boblu 來自: 131.212.202.90 (08/07 03:34)
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08/07 03:35, , 6F
修了文 推一下 請各位闆友再進來指導
08/07 03:35, 6F
推
08/07 04:21, , 7F
請問double digest時間多久? 以及plasmid和RE的量?
08/07 04:21, 7F
37C 四個半小時, pCS2+ 用了 4ug, RE各1uL
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08/07 04:24, , 8F
ligation的溫度?
08/07 04:24, 8F
16C O/N ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 05:30)
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08/07 09:11, , 9F
takara那組不是建議做bluntend才ON? 一般sticky 30
08/07 09:11, 9F
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08/07 09:12, , 10F
min就可以長一堆 不過ligation再怎樣接不上去
08/07 09:12, 10F
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08/07 09:13, , 11F
I+V那組應該也要長得跟V only一樣多..
08/07 09:13, 11F
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08/07 09:15, , 12F
而且TA剪下來貼上新的這成功率跟羊入虎口沒兩樣..
08/07 09:15, 12F
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08/07 09:18, , 13F
兩者做gel extraction後的品質呢?例如nanodrop顯示的
08/07 09:18, 13F
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08/07 09:19, , 14F
全波長讀值曲線有沒有鹽類太高 酒精沒甩乾淨
08/07 09:19, 14F
這方面應該是沒有問題 Wash 以後都有照 protocol 甩兩次 nanodrop 看起來也還算正常（不過我不太知道到什麼程度才算是太？） 最後的 elute buffer 裡面有 tris, 不過 Takara 的 kit 說明書裡面說那個 kit 喜歡 tris...
推
08/07 09:57, , 15F
這情況我還蠻常遇到的 CIP不是每次都很好
08/07 09:57, 15F
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08/07 09:57, , 16F
但只要ligation有長的 多挑一點就會挑到 所以建議原PO
08/07 09:57, 16F
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08/07 09:58, , 17F
就直接挑來check了吧
08/07 09:58, 17F
請問你的經驗多挑是要挑多少？ 我這個 construct 已經好幾次挑三十個都沒有東西的 過去的習慣都是十個挑不到就認為沒有成功了... ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 13:42)
推
08/07 14:41, , 18F
你該不會兩個搞反了吧?
08/07 14:41, 18F
?
推
08/07 17:59, , 19F
4ug 1uL RE切4小時有點不太夠..會有不完全切完的可能..
08/07 17:59, 19F
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08/07 18:01, , 20F
減少plasmid的量&增加切的時間再試試看吧...切ON試試?
08/07 18:01, 20F
推
08/07 19:19, , 21F
BamHI切ON要看廠牌XD EcoRI倒是沒差 最後ligation
08/07 19:19, 21F
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08/07 19:20, , 22F
也用不到那麼多的DNA 減量應該行的通'
08/07 19:20, 22F
我沒有 O/N 是怕 star activity 而且同時切了 TA construct, 裡面的 insert 有 release 出來 當然 可能有 gel 看不出來的沒切完全的部分 而且我 gel extraction 的時候, double digest 的 vector 的 band shift 沒有很大 所以還是有 切膠的時候就沾到沒切的 vector 這種狀況的可能吧 下次試試 O/N 然後把膠跑開一點再切看吧 ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/07 23:05)
推
08/07 23:53, , 23F
可以將ligation產物再用ClaI切30~60分鐘
08/07 23:53, 23F
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08/07 23:53, , 24F
不過要先確認你的insert有無ClaI切點
08/07 23:53, 24F
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08/07 23:56, , 25F
在pCS2上的BamHI及EcoRI兩切點中間剛好有ClaI site
08/07 23:56, 25F
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08/07 23:59, , 26F
可以將沒切乾淨vector給切除 這樣可不用重做
08/07 23:59, 26F
可惜剛剛好就是有 ClaI site :( 但是應該可以直接合成 oligo 把 pCS2+ 裡面的 ClaI site 置換掉？ 不過我沒有這樣做過 在哪些步驟需要額外的製換 buffer / 去鹽 / 濃縮嗎？ 還是 ligation product 直接加 RE 與 buffer 反應時間夠了以後 就可以直接拿去 transform? ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 03:32)
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08/08 03:32, , 27F
大 E 之後推一下 請大家繼續指教
08/08 03:32, 27F
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08/08 04:45, , 28F
如果做法都沒錯的話,建議你換個ligation kit吧,推薦roche
08/08 04:45, 28F
推
08/08 07:51, , 29F
你挑出來失敗的產物是比較像是self-ligation的嗎?
08/08 07:51, 29F
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08/08 07:51, , 30F
如果挑了10個都沒拿到 那可以考慮重做一批試試看
08/08 07:51, 30F
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08/08 07:51, , 31F
我覺得可能是enzyme digest跟CIP都沒完全造成的
08/08 07:51, 31F
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08/08 07:53, , 32F
你或許可以嘗試一下 讓digest時間拉長 CIP時間1hr夠了
08/08 07:53, 32F
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08/08 07:54, , 33F
只怕CIP是失去了活性 不過理論上兩刀應該不cip也沒差
08/08 07:54, 33F
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08/08 07:56, , 34F
大多的時候 vector only是可能會長 不過量非常少就是了
08/08 07:56, 34F
其實長了不少 所以我猜不是 self ligate 就是一開始就有帶到沒切動的 重做一次的時候會加作 vector only, no ligase 的 control 這樣就算做不出來 也會比較知道哪裡出問題
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08/08 07:56, , 35F
對了 你有分別單獨用兩種enzyme去試者切你的vector嗎?
08/08 07:56, 35F
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08/08 07:57, , 36F
說不定有一刀根本沒有 但是你看不出來??
08/08 07:57, 36F
沒有試那個 vector 不過因為作的時候是跟 TA construct side by side 作的 TA construct 要兩刀才會 release 出我要的片段 這一部分確定是有 work 的（但是不知道效率） 應該也可以由此推測 enzyme 跟 buffer 都是好的 除非 vector 續列特別造成不好切？ 重作的時候也一起試試看好了 感謝提醒 m<_ _>m ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 09:45)
推
08/08 12:42, , 37F
有時候是vector根本就是錯的或是壞的 這也是遇過
08/08 12:42, 37F
淦 現在想想還真的有可能 因為那管 pCS2+ 不是我抽的 我也沒有拿去 sequence 過...... hmm 真的至少應該送去把 MCS 部分 sequence 一下... （RFLP 未必看得出來 因為 pCS 系列好像很多 vector 切出來都會很類似？）
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08/08 12:42, , 38F
另外常見的錯誤有:1.plate抗生素壞了或是濃度錯了
08/08 12:42, 38F
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08/08 12:43, , 39F
所以你可以嘗試看看直接塗competent cell上去會不會長
08/08 12:43, 39F
這個錯誤事實上出現過 現在應該已經解決
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08/08 12:44, , 40F
或是2.操作的器具有汙染 不過這種colony會很明顯不是
08/08 12:44, 40F
這應該不至於
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08/08 12:45, , 41F
基本上這些都遇過 但是不保證真的有發生在你那邊..
08/08 12:45, 41F
謎 謎 謎 囧rz ※ 編輯: boblu 來自: 71.10.75.57 (08/08 14:07)
推
08/08 16:52, , 42F
100%這個數字在生物學上行不太通，就好像一開始碰cloning
08/08 16:52, 42F
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08/08 16:54, , 43F
一直以為enzyme在它喜歡的buffer裡，就會有100% activity
08/08 16:54, 43F
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08/08 16:56, , 44F
其實不然，雖然做double digestion但是難保vector同時被
08/08 16:56, 44F
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08/08 16:59, , 45F
兩種enzyme切到；以你的問題為例，說不是你的vector只被切
08/08 16:59, 45F
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08/08 17:00, , 46F
一刀，vector只留一個cutting site，ligation時…insert
08/08 17:00, 46F
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08/08 17:02, , 47F
只有一邊被接上，造成你的vector only的plate長很多…
08/08 17:02, 47F
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08/08 17:03, , 48F
vector+insert的plate長很少，當然這只是推測…Orz
08/08 17:03, 48F
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08/08 17:06, , 49F
建議確認vector上的MCS沒有壞，用EcoRI及另距離一很遠的
08/08 17:06, 49F
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08/08 17:07, , 50F
enzyme切切看，sequencing也是可以確認但有時不怎對...Orz
08/08 17:07, 50F
推
08/08 18:13, , 51F
找特異性序列或是重新從最初的stock拿來用..
08/08 18:13, 51F
推
08/09 10:25, , 52F
公用操作器具污染很好玩..送九千長一堆很高興
08/09 10:25, 52F
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08/09 10:25, , 53F
抽出來全部都三千 WTFS
08/09 10:25, 53F
推
08/09 13:06, , 54F
樓上同感...還有人給我分裝competent cell用用過的tip
08/09 13:06, 54F
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08/09 13:06, , 55F
什麼都不用加，長爽爽
08/09 13:06, 55F
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