Re: [求救] cloning 救郎喔~~
※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言：
: ※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: : 最近在做cloning,
: : 做到快發瘋了.
: : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: : 去切 insert 和 vector,
: : 跑電泳也確定有切動,
: : 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: : 可是隔天來看沒有長.....
: : 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: : 可是一樣都沒長,
: : 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: : 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
: 1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？
: 2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？
: 3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？
: 全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？
: (po 一下 你的步驟)
XhoI跟HindIII是可以合切的 用2號的樣子 雖然我是比較喜歡先後切
切完後膠回收 然後膠回收的產物回溶後取等量下去跑一片膠
再依band的亮度決定ligation的vector:insert
我習慣是...
vector跟insert的亮度去除以長度得到莫耳比 vector:insert 最好是1:3~5
例如
Ｖ ： Ｉ
亮度 １ ： １
----------------------------
長度 ５ ： １
這時候代表膠回收的產物濃度vector:insert大概是1:5
所以直接取1:1體積的vector跟insert下去ligation
ligation時先將二次水 vector insert加熱45℃ 5分鐘 於冰上待涼後
加入ligase跟buffer 這裡要注意buffer ligase buffer會有ATP在裡面
通常存於-20時會有白色沉澱 使用時務必要把白色沉澱溶解 (用震的)
(我記得這是ATP的沉澱...好像有點怪...)
之所以會有額外加ATP也是這個考量...怕沒溶或degrade...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.208.5
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那時候翻Molecular clone是說37℃ 5~10分鐘 詳細原因我倒是不知道
後來實驗室的protocal就被改成45℃ 也沒有原因....@@...
※ 編輯: greenmoon00 來自: 140.120.208.3 (12/14 14:00)
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