Re: [求救] cloning 救郎喔~~
※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言：
: ※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: : 最近在做cloning,
: : 做到快發瘋了.
: : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: : 去切 insert 和 vector,
: : 跑電泳也確定有切動,
: : 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: : 可是隔天來看沒有長.....
: : 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: : 可是一樣都沒長,
: : 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: : 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
: 1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？
: 2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？
: 3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
這一步是為什麼? 完全不懂
: 全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？
: (po 一下 你的步驟)
1.Hind III 及Xho I 一起切, 37度 overnight
2.run gel,gel extraction (bioman)
(在gel extraction後,我有跑電泳,確定DNA還在)
3.ligation,體積比insert/vector = 7:1
(我用的ligation buffer本身就含有 1mM ATP)
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 123.192.24.108
推
12/12 10:48, , 1F
12/12 10:48, 1F
推
12/12 12:54, , 2F
12/12 12:54, 2F
→
12/12 12:55, , 3F
12/12 12:55, 3F
推
12/12 22:23, , 4F
12/12 22:23, 4F
推
12/12 22:27, , 5F
12/12 22:27, 5F
討論串 (同標題文章)