Re: [求救] cloning 救郎喔~~
※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: 最近在做cloning,
: 做到快發瘋了.
: 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: 去切 insert 和 vector,
: 跑電泳也確定有切動,
: 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: 可是隔天來看沒有長.....
: 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: 可是一樣都沒長,
: 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
以uncut plasmid transform有長 表示plate跟competent cell沒問題
你的問題聽起來像是 ligation 失敗
可能的原因有很多 可以 google "ligation troubleshooting" 有很多資料
如果是 "完全沒長"
比較 major 的
1. ligase 或是 ligation buffer 壞掉 (ligation buffer含ATP要隨時放在冰上)
2. agarose 為 ligase inhibitor 如果沒弄乾淨會影響 ligation 效率
比較 minor 的
3. ligase 沒有 65度 inactivate 會影響 transformation 效率
4. 碰到過濃的 EtBr 或是染太久 會影響 ligation 效率
5. insert/vector 比例
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