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討論串[求救] cloning 救郎喔~~
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#1
[求救] cloning 救郎喔~~
推噓4(4推 0噓 2→)留言6則，0人參與, 最新作者bluehttp (蝦毀)時間16年前 (2007/12/12 01:17), 編輯資訊
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最近在做cloning,. 做到快發瘋了.. 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),. 去切 insert 和 vector,. 跑電泳也確定有切動,. 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,. 隔天再transform (DH5a)
(還有90個字)
#2
Re: [求救] cloning 救郎喔~~
推噓0(0推 0噓 0→)留言0則，0人參與, 最新作者HCCY (ㄟ區西西歪)時間16年前 (2007/12/12 02:26), 編輯資訊
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以uncut plasmid transform有長 表示plate跟competent cell沒問題. 你的問題聽起來像是 ligation 失敗. 可能的原因有很多 可以 google "ligation troubleshooting" 有很多資料. 如果是 "完全沒長". 比較 major
(還有144個字)
#3
Re: [求救] cloning 救郎喔~~
推噓0(0推 0噓 0→)留言0則，0人參與, 最新作者wensing (潛力股)時間16年前 (2007/12/12 02:30), 編輯資訊
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1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？. 2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？. 3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？. 全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？. (po 一下 你的
#4
Re: [求救] cloning 救郎喔~~
推噓4(4推 0噓 1→)留言5則，0人參與, 最新作者bluehttp (蝦毀)時間16年前 (2007/12/12 10:23), 編輯資訊
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^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^. 這一步是為什麼? 完全不懂. 1.Hind III 及Xho I 一起切, 37度 overnight. 2.run gel,gel extraction (bioman). (在gel extraction後,我有跑電泳,確定DN
#5
Re: [求救] cloning 救郎喔~~
推噓4(4推 0噓 1→)留言5則，0人參與, 最新作者cothuho (cothuho)時間16年前 (2007/12/12 13:41), 編輯資訊
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你的insertion 和vector長度比如何？. 長度接近 且insertion較長時 也比較難ligate. 另外 你的vector有沒有放夠量. 至少也要100ng 比較保險. 別只看膠上跑的粗細來判定 去測測濃度吧. DH5a細胞數不要太高 會影響transformation. 若要塗的細
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