Re: [求救] 怎麼做都做不出來..............
※ 引述《ppta (幸福的瞬間)》之銘言：
: : 一般應該是看primer的Tm值決定吧
: : 通常使用Tm-5度
: : 取兩個primer中Tm比較低的那個來計算
: : 如果做不出來就再減5度
: 哇，如果做不出來，tm低的減到10度都會變成四十多度了耶，真的可以嗎？可以的話我要
: 衝了。
: : 有沒有考慮過其他的問題?
: : ex.primer dimer
: 我的確一直有這個問題，是因為加過量嗎？加過量會造成做不出來嗎？如果是說引子會互
: 黏，真的會嗎？因為我都是參考paper來訂的耶。
: serotonin transporter的primer
: 5-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3 and 5-GAG GGA
: CTG AGC TGG ACA ACC A-3).
: 產物大小預計五百多bp
: gc content：61.9%
: tm1個是59.7度，
: 另一個
: gc content 65%
: tm是62.3度
: drd3
: 5 -
: GCT CTA TCTCCA ACT CTC ACA-3 , reverse primer: 5 -AAG TCT ACT CAC CTC
: CAG GTA-3
: 產物大小462bp
: gc content47.6%
: tm53.5
: 另一個gc content47.6%
: tn54.2
: tph
: forward primer, 5-
: TTCAGATCCCTTCTTCTATACCCCAGA-3; reverse
: primer, 5-GGACATGACCTAAGAGTTCATGGCA-3.
: 產物大小918bp
: gc content48%
: tn58.6
: 另一個
: gc content 44.4%
: tm58.6
: : 另外請問一下你的產物大小預計是多少?
: : 妳的template是什麼?(plasmid? genome?)
: template是口腔綿棒粹取出來的，應該是genome吧。
: : 還有妳寫DNA沒定量
: : 有時候DNA的量、copy數都會影響PCR成功與否
: 我的DNA都是別人測試過夾得出東西的，
: 我自己也有夾出一個基因，這樣還會是DNA濃度的問題嗎？
: : 最好還是定一下量比較好
: : 你說paper寫annealing溫度55
: : 意思是說你的primer是和那篇paper使用的primer一樣嗎?
: : 那麼我覺得annealing溫度應該不是問題
: : 照他的55度應該做的出來
: 我的條件全都按照paper來做的。只是我這兩週都直接降到50度，因為我先前都是按照
: paper的溫度有做成功一、兩次（做幾十次吧，而且超弱），後來再也做不出來，現在
: 乾脆全降到五十度，想說先做出雜band再來升溫度，結果還是做不出來。
: : 你的問題可能在template的取得、酵素的好壞(有時候酵素會壞掉)
: : 會是其他問題
: dna是近一個月學弟剛萃完而且夾他的基因超亮的，我也有分裝，這幾天把buffer、taq
: dntp都換掉，還是沒有。
: : 也有可能你的template中根本沒有那個基因??
: 應該不可能，這些基因每個人都有，這些基因是人類很有名的基因，跟犯罪有關的基因。
看了一下..你的產物都不是很大
一般Taq的效率..一分鐘可以做1-2Kb
你的應該只要40秒就好了
做太久也許dNTP都浪費在不必要的部份(可是你dNTP又放不少..好像不會不夠)
有沒有可能是primer廠商沒有合成好
也許序列有點不同(雖然機率不大)
所以primer黏上去的效果不好
或是你的primer還是DNA是不是溶在TE buffer?
EDTA會影響PCR效率
至於primer dimer問題
你可以把primer減少點
我們家通常是用最終濃度0.2 micro M (也就是你的1/5)
primer太濃..是比較容易形成primer dimer
我是覺得既然同樣的基因..同樣的primer
沒道理別人55度可以發paper
你卻會做不出來
問題應該不是在Ta上
如果真的擔心Ta的問題
那就做個gradient試試看吧
有時候PCR做不出來就只能什麼東西都試試看
我有次做了好多次測試還是一直P不出來
老闆看不下去..親自做..結果一次就做出來了
害我被臭罵一頓
結果原因是Taq的問題
我之前用的時候是舊的那罐Taq..用到快沒了
老闆做的時候剛好換新的
後來我所有東西都用原先的..只有Taq是新的那罐
就沒有問題了
只能說..這就是人生=___=
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