Re: [求救] 怎麼做都做不出來..............
: : 來改其他的條件。有雜band沒關係，天知道我多想看一看雜band來改進啊。
: 一般應該是看primer的Tm值決定吧
: 通常使用Tm-5度
: 取兩個primer中Tm比較低的那個來計算
: 如果做不出來就再減5度
哇，如果做不出來，tm低的減到10度都會變成四十多度了耶，真的可以嗎？可以的話我要
衝了。
: 有沒有考慮過其他的問題?
: ex.primer dimer
我的確一直有這個問題，是因為加過量嗎？加過量會造成做不出來嗎？如果是說引子會互
黏，真的會嗎？因為我都是參考paper來訂的耶。
serotonin transporter的primer
5-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3 and 5-GAG GGA
CTG AGC TGG ACA ACC A-3).
產物大小預計五百多bp
gc content：61.9%
tm1個是59.7度，
另一個
gc content 65%
tm是62.3度
drd3
5 -
GCT CTA TCTCCA ACT CTC ACA-3 , reverse primer: 5 -AAG TCT ACT CAC CTC
CAG GTA-3
產物大小462bp
gc content47.6%
tm53.5
另一個gc content47.6%
tn54.2
tph
forward primer, 5-
TTCAGATCCCTTCTTCTATACCCCAGA-3; reverse
primer, 5-GGACATGACCTAAGAGTTCATGGCA-3.
產物大小918bp
gc content48%
tn58.6
另一個
gc content 44.4%
tm58.6
: 另外請問一下你的產物大小預計是多少?
: 妳的template是什麼?(plasmid? genome?)
template是口腔綿棒粹取出來的，應該是genome吧。
: 還有妳寫DNA沒定量
: 有時候DNA的量、copy數都會影響PCR成功與否
我的DNA都是別人測試過夾得出東西的，
我自己也有夾出一個基因，這樣還會是DNA濃度的問題嗎？
: 最好還是定一下量比較好
: 你說paper寫annealing溫度55
: 意思是說你的primer是和那篇paper使用的primer一樣嗎?
: 那麼我覺得annealing溫度應該不是問題
: 照他的55度應該做的出來
我的條件全都按照paper來做的。只是我這兩週都直接降到50度，因為我先前都是按照
paper的溫度有做成功一、兩次（做幾十次吧，而且超弱），後來再也做不出來，現在
乾脆全降到五十度，想說先做出雜band再來升溫度，結果還是做不出來。
: 你的問題可能在template的取得、酵素的好壞(有時候酵素會壞掉)
: 會是其他問題
dna是近一個月學弟剛萃完而且夾他的基因超亮的，我也有分裝，這幾天把buffer、taq
dntp都換掉，還是沒有。
: 也有可能你的template中根本沒有那個基因??
應該不可能，這些基因每個人都有，這些基因是人類很有名的基因，跟犯罪有關的基因。
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