Re: [求救] 誘導表現蛋白質
請問一下您的蛋白質分子量是多少?
基本上大於100 kDa的protein在E. coli內的表現就會比較不好
另外真核membrane protein可能會有一些修飾作用, 在E. coli內無法進行而有毒性
Membrane protein也很容易形成inclusion body
如果先不考慮技術層面的因素
我個人的建議是
1. 選用E. coli C41 可耐受較強的蛋白質毒性
2. 換用yeast expression system, 尤其是大分子量的真核細胞膜蛋白
3. 選用分子量較大的tagged-fusion protein system (like INTEIN)
因為分子量夠大, 可以破壞蛋白質的構形, 容易避免毒性和inclusion body
※ 引述《content71 (羅莉飼養中...)》之銘言：
: 先對原PO說聲不好意思，借用你的標題
: 因為我也遇到induction的問題急著想找人幫忙
: 我的狀況是
: vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag)
: E. coli strain : BL21(DE3)
: BL21(DE3)pLysS
: Rosetta(DE3)
: induction : E. coli OD600 ~0.4
: 0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr
: result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生長，SDS-PAGE check無表現
: BL21(DE3)pLysS 在induction後會繼續長，但SDS-PAGE check無表現
: western check在uninduce及induce都有表現但很少,leakage?
: Rosetta(DE3) transformation後就沒出現colonies了 (試過兩次)
: 我自己的推測是
: 此protein對E.coli有強毒性，所以一但induction菌就會掛掉或不生長
: 現在想到的是 1. 降溫induction延長時間
: 2. 換Rosetta(DE3)pLysS (但我們老師肯定不會買...太了解他orz)
: 3. 換表現菌種
: 4. 大量培養，硬是純化 (最後的辦法，算過大概需3 miligram)
: 怎麼辦阿....我快哭出來了
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