Re: [求救] 誘導表現蛋白質
※ 引述《content71 (羅莉飼養中...)》之銘言：
: ※ 引述《pneumonia.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (JUAN)》之銘言：
: : 照你的描述 最可能就是被破壞掉了
: : 你當然可以加PMSF
: : 但我猜效果大概不大
: : 破菌的過程蛋白質被降解的機會很小
: : 另一種可能的辦法是 換到Novablue (DE3)表現
: : 也許可以解決
: : 雖然你說有測過 我覺得比較可能的是很多都跑到沉澱物的部份去了
: 先對原PO說聲不好意思，借用你的標題
: 因為我也遇到induction的問題急著想找人幫忙
: 我的狀況是
: vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag)
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你有去確認過你的CODON是Ecoli要的嗎~~~~~
如果沒有 可能試著做看看Rosseta 要要看
它可以補充 7種 E. coli缺的7種真核的codon
膜蛋白的表現原本就比較少~~~不好拿~~(聽說囧)
: E. coli strain : BL21(DE3)
: BL21(DE3)pLysS
: Rosetta(DE3)
: induction : E. coli OD600 ~0.4
: 0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr
: result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生長，SDS-PAGE check無表現
: BL21(DE3)pLysS 在induction後會繼續長，但SDS-PAGE check無表現
: western check在uninduce及induce都有表現但很少,leakage?
: Rosetta(DE3) transformation後就沒出現colonies了 (試過兩次)
勝任細胞沒做好
: 我自己的推測是
: 此protein對E.coli有強毒性，所以一但induction菌就會掛掉或不生長
: 現在想到的是 1. 降溫induction延長時間
: 2. 換Rosetta(DE3)pLysS (但我們老師肯定不會買...太了解他orz)
: 3. 換表現菌種
: 4. 大量培養，硬是純化 (最後的辦法，算過大概需3 miligram)
induction的濃度跟時間溫度 都要抓 我自己遇到的有些三小時就可以
有些要7小時 也看過PAPER 30min就可以的~~~
: 怎麼辦阿....我快哭出來了
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05/10 13:25, , 1F
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