Re: [求救] 誘導表現蛋白質

看板Biotech作者content71 (羅莉飼養中...)時間18年前 (2007/05/09 10:13)推噓3(3推 0噓 5→)

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※ 引述《pneumonia.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (JUAN)》之銘言： : ※ 引述《u8524009.bbs@ptt.cc (VIP好人卡....)》之銘言： : > 要先問一下你所謂的破菌後蛋白質少很多..是你用那一個fraction去跑膠得到的結果 : > 不曉得你有沒有測過你的目標蛋白質是soluble form還是inclusion body? : > 假設你的蛋白質是inclusion body,而你取上清液去跑膠; : > 亦或是你的蛋白質是soluble form,而你取離心後不溶的pellete去跑膠 : > 都會得你像你所說的破菌後,蛋白質減少很多的現象 : 照你的描述最可能就是被破壞掉了 : 你當然可以加PMSF : 但我猜效果大概不大 : 破菌的過程蛋白質被降解的機會很小 : 另一種可能的辦法是換到Novablue (DE3)表現 : 也許可以解決 : 雖然你說有測過我覺得比較可能的是很多都跑到沉澱物的部份去了先對原PO說聲不好意思，借用你的標題因為我也遇到induction的問題急著想找人幫忙我的狀況是 vector : 真核human membrane protein接入pET28a (His-tag) E. coli strain : BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) induction : E. coli OD600 ~0.4 0.5mM, 1mM, for 37度C, 3hr result --> BL21(DE3) 在induction後就不太生長，SDS-PAGE check無表現 BL21(DE3)pLysS 在induction後會繼續長，但SDS-PAGE check無表現 western check在uninduce及induce都有表現但很少,leakage? Rosetta(DE3) transformation後就沒出現colonies了 (試過兩次) 我自己的推測是此protein對E.coli有強毒性，所以一但induction菌就會掛掉或不生長現在想到的是 1. 降溫induction延長時間 2. 換Rosetta(DE3)pLysS (但我們老師肯定不會買...太了解他orz) 3. 換表現菌種 4. 大量培養，硬是純化 (最後的辦法，算過大概需3 miligram) 怎麼辦阿....我快哭出來了 -- 有人說，兩個人的生活圈被劃開了，所以會有隔閡。但是，換個角度想，因為生活圈的不同，應該也有更多東西可以分享。因為一定有一方接觸的新事物，是對方不知道的。只是看兩個人有沒有心分享對方的生活而已。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.99.187 ※ 編輯: content71 來自: 140.114.99.187 (05/09 12:52)

推

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