Re: [討論] PCR技術

看板Biotech作者Ianthegood (雜碎。)時間13年前 (2011/06/12 20:24)推噓1(1推 0噓 6→)

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※ 引述《karas888 (爆熱武者無雙抖抖丸 )》之銘言： : 謝謝雜碎大哥XD : 專業的講解非常清楚XD!!超級感謝 : 因為小弟非生物背景所以還有很多問題 : 在下想問清楚!! : ※ 引述《Ianthegood (雜碎。)》之銘言： : : 同學 : : 你可能資料要再看清楚喔 : : 電泳是用來分析DNA片段大小用的 : : 如果DNA量不夠 : : 電泳的靈敏度有限跑出來還是會看不到 : : PCR系列的技術是用來放大DNA片段用的 : : 一般都是pcr放大完再用電泳來檢視結果這樣 : : 然後你說的那個什麼熱交換我真的不知道是什麼XD (通常是散熱器吧?) : : PCR是利用DNA在不同溫度兩股會分開與重新黏合的概念 : : 加上合成酵素適合高溫 : DNA再因為熱對流循環會造成三階段溫度 : 97度左右開始變性 52度左右黏合 74度左右擴增 : 97度會變性是因為DNA本身到這個溫度就會氫鍵裂解嗎? : 還有就是說那您在這邊提到的說到合成酵素適合的高溫 : 是指說這個熱循環需要黏合的最低溫度是由此酵素決定的嗎? DNA的長度跟其變性溫度有很大的關係 94度大概是雙股DNA裡面的氫鍵全部會打開的溫度 dsRNA或是DNA-RNA hybrid要再高幾度五十幾度是primer黏合到template上面的溫度 primer就是人工合成用來放大所需片段用的小片段單股DNA 一般物種的genome大概都是破百萬個base pair primer一般是20到30個nucleotide之間 primer會做兩個一左一右剛好把你要的sequence夾起來那這個五十幾度的溫度就是primer跟template之間可以開始黏合的溫度 template自己的雙股因為太大所以沒辦法這麼快黏起來接著上72度這是大部分DNA polymerase最適合工作的溫度效率最高以基本款的taq polymerase來講大概一分鐘1K的長度理論上也可以不要上去留在五十幾度不過效率就會很糟時間就要留很久然後重複這個cycle 從primer新做好的股又會被打開變成新的template 於是就等比上去了 : 以高溫低溫的循環讓DNA產生2的N次方的放大(N=cycle數) : : 一般都是跑30+cycles 放大幾倍可以自己算一下 : : 電泳是把膠體放在溶液裡 : : DNA再放在膠體裡 : : 溶液通電之後導致大小不同的分子在膠內移動距離不同的現象 : : 定量的部份就是染色後這些分子團顯現出的亮度 : : 分子越多越亮 : : 簡單說就是這樣 : : 然後qPCR : : 就是你提到的螢光 : : 利用的是具有螢光的原料來進行PCR : : 所以在每個cycle的放大中螢光就會逐漸增強 : : 借此來達到定量的效果 : : 那為什麼不全面放棄電泳呢 : : 貴阿 : : qPCR的機器耗材軟體有的沒的而且template的純度要求很高 : : 比起來電泳的成本跟自來水一樣(菸) : 在電泳法對分離開來的分子量做量化處理也是使用螢光染劑? : 那跟qpcr這裡的螢光染劑有什麼不同阿? : 還有就是real-time pcr 跟qPCR差在哪裡阿? : 有網友推文說差再定量方式? : 真的很好奇 : 謝謝您>"< 電泳確實是用螢光染劑沒錯不過因為PCR是個奇妙的反應有可能你的產物到某個濃度就不會再增加了或是到第幾個cycle primer就用完了因gene而異(也不一定是gene @@) 理論上你可以同時做35管同樣的反應然後在每個cycle終止一管的反應再全部拿去跑膠就可以得到類似qPCR的結果但是很累所以才有real-time PCR 又稱quantitative PCR 或是real-time quantitative PCR的誕生這個東西嚴格說起來並不是染劑去與DNA結合而是它的原料本身會發光在機器裡面反應的過程直接有個detector抓它的吸光醬這個跟reverse transcription PCR (RT-PCR又是完全的不同) 後者為將RNA反轉錄成DNA用的這也牽扯到qPCR的發展因為學者們對於真正活體內RNA的量很好奇而前面有提經過普通的PCR無差別放大之後你的初始量就幾乎不可能定了因此才會有qPCR的誕生另外還是要講一下 google很好用的維基很多不是最尖端科技的東西資料也都很豐富自己動手記得會比較牢阿 -- 人好欠表 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 110.174.79.41

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a90648

06/12 22:07, , 1^F

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※ 編輯: Ianthegood 來自: 110.174.79.41 (06/13 00:10)

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Ianthegood

06/13 00:11, , 2^F

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usl2736

06/13 07:15, , 3^F