Re: [求救] western blot 全黑
哈 我再說清楚一點齁@@
步驟是
1. transfer 完的 membrane 用 5% 牛奶blocking 1.5 h
2. 倒掉牛奶 加入 1抗 (用blocking 溶液 1:1000稀釋泡成的)
3. 4度C overnight後 又 37度C 1hr
4. wash 30min (每10min換一次新的1 x TBST)
5. 加入2抗 搖 1hr
6. wash (同4)
7 加ECL 壓片
我在想可能是我一抗不需要再搖37度C了齁
再稀釋然後4度C overnight就好了齁@@!!
※ 引述《linwei (我會好好加油^^)》之銘言：
: 謝謝大家的建議
: 我稀釋的比例是 1:1000
: 然後是用5%的牛奶泡成的抗體(同時也是我們的blocking溶液)
: 抗體是新泡的 (因為我是跟我同學要原液回來泡的喔)
: 然後只做一次(就是全亮的這一次@@")
: 我想我會再稀釋我的一抗的濃度
: 譬如說我原本泡的有10c.c
: 我想我會先取2c.c.出來，再加2c.c的牛奶再對半稀釋
: 然後再試試看
: 謝謝大家的熱心建議 :)
: ※ 引述《SPK (雲淡風輕)》之銘言：
: : 片子都已經全黑了要嘛過度曝光，要嘛就是substrate太多，你自己去看的結果也是整
: : 片亮那就是substrate太多了啦，你加點水稀釋一下。
: : 如果是抗體有問題，問題也不會出現在二抗，而是一抗亂黏的機會比較大，看是不是
: : reuse太多次了，當然monoclone的ab是比較純比較好但也比較貴，不一定ployclone的就
: : 做不出來啊，而且也不一定每次都有monoclone的可以買。
: : 不過有沒有可能是blocking沒做好呢？再泡一次脫脂奶粉試試吧。再不行就殘忍一點用
: : BSA去BLOCK。
: : 首先我覺得你先把一抗換新，再來把你的substrate稀釋稀一點再去反應，然後在蓋片子
: : 之前先關燈看一下會不會再次整片發亮。如果會的話就不要浪費片子了。
: : 另外，不知道你用的是單面片還是雙面片，如果是單面的話~~你還是換一下好了，那個太
: : 敏感了，雙面片就很好用了。
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◆ From: 220.229.173.66
推
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