Re: [求救] western blot 全黑
謝謝大家的建議
我稀釋的比例是 1:1000
然後是用5%的牛奶泡成的抗體(同時也是我們的blocking溶液)
抗體是新泡的 (因為我是跟我同學要原液回來泡的喔)
然後只做一次(就是全亮的這一次@@")
我想我會再稀釋我的一抗的濃度
譬如說我原本泡的有10c.c
我想我會先取2c.c.出來，再加2c.c的牛奶再對半稀釋
然後再試試看
謝謝大家的熱心建議 :)
※ 引述《SPK (雲淡風輕)》之銘言：
: ※ 引述《linwei (我會好好加油^^)》之銘言：
: : 請益各位
: : 因為我第一次遇到這種情況@@
: : 我壓的protein 是 cleaved caspase 3
: : 使用的抗體是 cell signaling 編號9661 的抗體
: : 今天我做實驗
: : 壓出來一整片都是黑的
: : 結果關燈發現整片menbrane都發亮
: : 我很確定我二抗沒有給錯啦@@ 且也有很努力的wash乾淨
: : 因為抗體是跟別人要的
: : 且我同學他也沒有做過這個protein @@
: : 有人跟我說 如果是 Polyclonal antibodies 的
: : 他的專一性也會比較差
: : 會是這個原因嗎?
: : 該怎麼改善呢?
: : 希望有做過的版友可以提供我一點意見
: : 好讓我下次再試的時候知道該怎麼改進@@
: : 感恩感謝～！！！！！
: 片子都已經全黑了要嘛過度曝光，要嘛就是substrate太多，你自己去看的結果也是整
: 片亮那就是substrate太多了啦，你加點水稀釋一下。
: 如果是抗體有問題，問題也不會出現在二抗，而是一抗亂黏的機會比較大，看是不是
: reuse太多次了，當然monoclone的ab是比較純比較好但也比較貴，不一定ployclone的就
: 做不出來啊，而且也不一定每次都有monoclone的可以買。
: 不過有沒有可能是blocking沒做好呢？再泡一次脫脂奶粉試試吧。再不行就殘忍一點用
: BSA去BLOCK。
: 首先我覺得你先把一抗換新，再來把你的substrate稀釋稀一點再去反應，然後在蓋片子
: 之前先關燈看一下會不會再次整片發亮。如果會的話就不要浪費片子了。
: 另外，不知道你用的是單面片還是雙面片，如果是單面的話~~你還是換一下好了，那個太
: 敏感了，雙面片就很好用了。
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