Re: [求救] primary culture cell
※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之銘言：
: 各位大大安安:
你好 就自己以前一些經驗大家一起來分享討論
經驗不足的地方 請鞭小力點
: PI最近給我一個任務
: 要我culture "cerebullum of new born mice"
: 他應該是要培養神經細胞
: 之後要用electroporation 把DNA送進神經裡面......
: 但是我之前完全沒有primary culture cell的經驗
若你以前有培養cell line的經驗
請先有一個認知 cell line & primary culture 有根本上的差異存在
: 所以想跟大家請教幾個我查不到答案~
: 還有不大確定答案的問題
: 1.因為我第一次做,很不熟練,
: 所以一開始花了很多時間(大約要半小時/per mice@@)
: 在取出小腦,去掉腦膜,顯微鏡下切成小塊這些步驟....
: 不知道我花這麼久的時間,會不會讓細胞死了一大半??(我再切的時候
: 細胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的)
: 如果我做太久會導致細胞大量死掉的話,有沒有其他方法可以補救?
: (沒辦法我ㄧ開始真的是手殘不協調...我也很想快點弄完)
首先這部分 只能說細胞死了就死了 既然都了解最大因素在"時間"上
也只能麻煩你盡快進入狀況 熟能生巧
0.5hr/mice 是因為你們實驗中的設計個體間有不同的處理嗎?
不然就取sample這階段 應該是一次就取一批的量才容易實驗的進行吧
為求tissue 保持新鮮 迅速消毒 斷頭 取組織 一隻速度應不需3分鐘(這不誇張)
腦膜除去 熟練的話 其實很快 尤其是開腦取腦的動作做的很乾淨漂亮
另請教你們是用何種方法去打散細胞?
: 2.切完之後,因為沒有馬上要culture,所以依照protocol上面的敘述
: 把他們cryopreserve...冷凍在-70(加DMSO)....但是因為我一次要
: 犧牲五六隻老鼠,cryoperserve box又不夠,所以我每做完一隻
: 是放在冰裡面,等全部的sample都弄完了再一起放進-70
: 上次我ㄧ共花了三個小時才做完全部><(五隻)...請問
: 這樣子細胞會死光嗎??還有~我問我們那邊的博士後~他跟我說
: (他是日本人)在他們那邊,他們神經細胞不冰-70度,
: 都是馬上culture起來,因為神經細胞冰起來很容易死掉
: 就算是放了DMSO也一樣...但是因為paper上面是寫可以冰起來
: 我又查不道這方面的資訊..所以想要確認一下哪個才是對的>//<
這地方很奇怪 tissue處理完後的細胞沒有馬上要養
那請問你去分離這一批細胞是為了??
又因為primary cell是很嬌嫩的 尤其是neuronal cells
沒有細心照料他都會漂給你看了 現在卻還要給他冰起來
或許是我脫離這圈子有點久了(小的目前服役中)
但認知下沒有特殊因素的話 處理primary細胞很少會作到冷凍處理的步驟
更何況只有"-70"的處理保存下
大概分享自己經驗(primary cortex cell culture)
newborn cortex tissue打散分盤後先培養一個禮拜 先觀察細胞是否穩定
因剛打下來的細胞是很脆弱的 在確定是否有正常穩固貼附及生長時 是盡量不打擾
再依自己實驗需要換medium或其他處理 (細節不談)
: 3.paper上面是寫可以culture 28天以上....
: 想要請教大家, new born的神經,在培養的時候,他的數量(生長)會增加嗎?
: 還是他只能分化?最多可以培養多久(或幾代??)有沒有什麼特別要注意的~
: 以增加存活率?...因為到時候要electroporation...怕細胞不夠到時候
: 全沒了@@
純neuronal cell是沒嘗試過養這麼久
但養過的mixed primary culture cells中
養到第28天的幾乎都是glia cells; neuron population很低
所以請自行查閱想養的細胞特性
另在brain tissue中 可以分生分化的blast cells是很少的
少到我們實驗室都是忽略他們的存在 而且一般的medium無法有效的激活他們
除非你們有作特地的處理
所以大致上都視作 數量密度維持恆定 至少只會減少不會增加
所以還沒聽過可以養"幾代"這種話
只有分過astrocyte & microglia 但好像沒有"代"差別在
: 4.跟細胞培養無關的問題@@
: 我有爬文
: 但是還是想問問.....關於新生mice mark的問題
: 帶我的老師要我剪小鼠的腳趾.....有一些小鼠
: 會養超過半年....當他們長大之後
: 我要把它們抓起來~肚子朝上才能看腳趾
: 但是我有一點恐懼症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他們的neck
: 所以現在正在練習怎麼把它們抓起來check 他們的腳趾
: 我的情況還蠻嚴重的
: 每次一碰到他們的脖子我都會有退縮反射
: 目前還不成功~我正在努力克服
: 但是可能需要一段時間
: ~所以想要請教大家
: 有沒有其他mark的方法
: 可以持續半年
剪耳標試看看吧
: 又適合我目前的情況??(只要編號一到五)
: (如果可以的話有沒有方法可以編號1到99@@??)
: 我是個新手菜鳥
: 這方面的知識我還不大懂~希望大大能夠教教我~或是給我ㄧ個指引
: 各訴我哪邊可以習得相關知識....
: 先謝謝大家的幫忙了........感恩~^^
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