Re: [求救] primary culture cell
※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之銘言：
: 各位大大安安:
: PI最近給我一個任務
: 要我culture "cerebullum of new born mice"
: 他應該是要培養神經細胞
: 之後要用electroporation 把DNA送進神經裡面......
: 但是我之前完全沒有primary culture cell的經驗
: 所以想跟大家請教幾個我查不到答案~
: 還有不大確定答案的問題
: 1.因為我第一次做,很不熟練,
: 所以一開始花了很多時間(大約要半小時/per mice@@)
: 在取出小腦,去掉腦膜,顯微鏡下切成小塊這些步驟....
: 不知道我花這麼久的時間,會不會讓細胞死了一大半??(我再切的時候
: 細胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的)
: 如果我做太久會導致細胞大量死掉的話,有沒有其他方法可以補救?
: (沒辦法我ㄧ開始真的是手殘不協調...我也很想快點弄完)
我也不算是新手,不過我的實驗材料也是primary neuronal culture,
所以我想可以提供我的經驗...
一般來說,neuron是不會再分裂的細胞,而且還蠻脆弱的,
所以我都是在冰上完成dissection,然後把馬上種到PDL-coated plate,
整個過程,快的話也是不會超過半個小時...
: 2.切完之後,因為沒有馬上要culture,所以依照protocol上面的敘述
: 把他們cryopreserve...冷凍在-70(加DMSO)....但是因為我一次要
: 犧牲五六隻老鼠,cryoperserve box又不夠,所以我每做完一隻
: 是放在冰裡面,等全部的sample都弄完了再一起放進-70
: 上次我ㄧ共花了三個小時才做完全部><(五隻)...請問
: 這樣子細胞會死光嗎??還有~我問我們那邊的博士後~他跟我說
: (他是日本人)在他們那邊,他們神經細胞不冰-70度,
: 都是馬上culture起來,因為神經細胞冰起來很容易死掉
: 就算是放了DMSO也一樣...但是因為paper上面是寫可以冰起來
: 我又查不道這方面的資訊..所以想要確認一下哪個才是對的>//<
跟你賭,一定會死光...
原因也是像1. 所說的, 我們lab隔壁的助理之前還把primary culture在DIV4時分盤,
結果當然是細胞全部飄起來給他看.....
可以告訴我paper的title嗎?
: 3.paper上面是寫可以culture 28天以上...
: 想要請教大家, new born的神經,在培養的時候,他的數量(生長)會增加嗎?
: 還是他只能分化?最多可以培養多久(或幾代??)有沒有什麼特別要注意的~
: 以增加存活率?...因為到時候要electroporation...怕細胞不夠到時候
: 全沒了@@
如果你要養glial cell,好像可以分3~4代沒問題,不過要用特定的medium去篩,
neuron的話,只有在neocortex的地方,有具有分裂能力的細胞,
所以基本上,作primary neuronal culture只能認命的犧牲pup來作...
: 4.跟細胞培養無關的問題@@
: 我有爬文
: 但是還是想問問.....關於新生mice mark的問題
: 帶我的老師要我剪小鼠的腳趾.....有一些小鼠
: 會養超過半年....當他們長大之後
: 我要把它們抓起來~肚子朝上才能看腳趾
: 但是我有一點恐懼症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他們的neck
: 所以現在正在練習怎麼把它們抓起來check 他們的腳趾
: 我的情況還蠻嚴重的
: 每次一碰到他們的脖子我都會有退縮反射
: 目前還不成功~我正在努力克服
: 但是可能需要一段時間
: ~所以想要請教大家
: 有沒有其他mark的方法
: 可以持續半年
: 又適合我目前的情況??(只要編號一到五)
: (如果可以的話有沒有方法可以編號1到99@@??)
: 我是個新手菜鳥
: 這方面的知識我還不大懂~希望大大能夠教教我~或是給我ㄧ個指引
: 各訴我哪邊可以習得相關知識....
: 先謝謝大家的幫忙了........感恩~^^
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