Re: [求救] primary culture cell
※ 引述《powergen85 (Uma)》之銘言：
: ※ 引述《cuteyinyin (泰迪小熊 )》之銘言：
: : 各位大大安安:
: : PI最近給我一個任務
: : 要我culture "cerebullum of new born mice"
: : 他應該是要培養神經細胞
: : 之後要用electroporation 把DNA送進神經裡面......
: : 但是我之前完全沒有primary culture cell的經驗
: : 所以想跟大家請教幾個我查不到答案~
: : 還有不大確定答案的問題
: : 1.因為我第一次做,很不熟練,
: : 所以一開始花了很多時間(大約要半小時/per mice@@)
: : 在取出小腦,去掉腦膜,顯微鏡下切成小塊這些步驟....
: : 不知道我花這麼久的時間,會不會讓細胞死了一大半??(我再切的時候
: : 細胞是放在culture medium之中....medium 是依照protocol配置的)
: : 如果我做太久會導致細胞大量死掉的話,有沒有其他方法可以補救?
: : (沒辦法我ㄧ開始真的是手殘不協調...我也很想快點弄完)
: 我也不算是新手,不過我的實驗材料也是primary neuronal culture,
: 所以我想可以提供我的經驗...
: 一般來說,neuron是不會再分裂的細胞,而且還蠻脆弱的,
: 所以我都是在冰上完成dissection,然後把馬上種到PDL-coated plate,
: 整個過程,快的話也是不會超過半個小時...
小的不才，也剛好做過primary culcure
但我做的是取DRG，也就是背根神經節
一次大概快要兩小時，一次約5-8隻
取下後馬上放在冰上的HBSS buffer 裡
直至全部取完
之後也是跟powergen85一樣，馬上種下去養
只是我的plate條件不太一樣，coating的是poly D lysine 跟 Laminin
但是因為DRG的神經細胞純度不似brain好，還要再加藥阻礙fibroblast的生長
: : 2.切完之後,因為沒有馬上要culture,所以依照protocol上面的敘述
: : 把他們cryopreserve...冷凍在-70(加DMSO)....但是因為我一次要
: : 犧牲五六隻老鼠,cryoperserve box又不夠,所以我每做完一隻
: : 是放在冰裡面,等全部的sample都弄完了再一起放進-70
: : 上次我ㄧ共花了三個小時才做完全部><(五隻)...請問
: : 這樣子細胞會死光嗎??還有~我問我們那邊的博士後~他跟我說
: : (他是日本人)在他們那邊,他們神經細胞不冰-70度,
: : 都是馬上culture起來,因為神經細胞冰起來很容易死掉
: : 就算是放了DMSO也一樣...但是因為paper上面是寫可以冰起來
: : 我又查不道這方面的資訊..所以想要確認一下哪個才是對的>//<
: 跟你賭,一定會死光...
: 原因也是像1. 所說的, 我們lab隔壁的助理之前還把primary culture在DIV4時分盤,
: 結果當然是細胞全部飄起來給他看.....
: 可以告訴我paper的title嗎?
這邊我想，應該也不太適合凍起來
因為我沒有凍過
取下的神經細胞，狀況良好的話，可以維持兩週(一定要加NGF)
但是之後神經細胞會逐漸變少，因為不會生長及有其他細胞搶養分的關係
: : 3.paper上面是寫可以culture 28天以上...
: : 想要請教大家, new born的神經,在培養的時候,他的數量(生長)會增加嗎?
: : 還是他只能分化?最多可以培養多久(或幾代??)有沒有什麼特別要注意的~
: : 以增加存活率?...因為到時候要electroporation...怕細胞不夠到時候
: : 全沒了@@
: 如果你要養glial cell,好像可以分3~4代沒問題,不過要用特定的medium去篩,
: neuron的話,只有在neocortex的地方,有具有分裂能力的細胞,
: 所以基本上,作primary neuronal culture只能認命的犧牲pup來作...
我們只使用兩週內的新鮮神經細胞來做實驗
畢竟狀況很難維持(這邊是指神經的純度要高)
28天確實有養過，也還活著，但是我們的目標是不加藥去培養神經細胞
這就有難度(或是我不知道有什麼好方法)
所以要實驗都要新取(這點真的很辛苦，老鼠也是)
: : 4.跟細胞培養無關的問題@@
: : 我有爬文
: : 但是還是想問問.....關於新生mice mark的問題
: : 帶我的老師要我剪小鼠的腳趾.....有一些小鼠
: : 會養超過半年....當他們長大之後
: : 我要把它們抓起來~肚子朝上才能看腳趾
: : 但是我有一點恐懼症~我敢抓尾巴,但是不敢抓他們的neck
: : 所以現在正在練習怎麼把它們抓起來check 他們的腳趾
: : 我的情況還蠻嚴重的
: : 每次一碰到他們的脖子我都會有退縮反射
: : 目前還不成功~我正在努力克服
: : 但是可能需要一段時間
: : ~所以想要請教大家
: : 有沒有其他mark的方法
: : 可以持續半年
: : 又適合我目前的情況??(只要編號一到五)
: : (如果可以的話有沒有方法可以編號1到99@@??)
: : 我是個新手菜鳥
: : 這方面的知識我還不大懂~希望大大能夠教教我~或是給我ㄧ個指引
: : 各訴我哪邊可以習得相關知識....
: : 先謝謝大家的幫忙了........感恩~^^
我們實驗室的人會用分籠兼畫尾巴記號來編號
小cage一籠放個八隻，然後可以自己想長短的前後編排在尾巴上做記號
然後籠子編號
這樣實驗時不會眼花撩亂(一籠只有八隻)
也不必跟老鼠腳指搏鬥
參考看看囉
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 219.81.161.54
打得太簡略怕大家看不懂，補幾個字，謝謝。
※ 編輯: asophisca 來自: 219.81.161.54 (05/30 22:23)
※ 編輯: asophisca 來自: 61.31.175.179 (05/31 21:24)
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 3 之 4 篇)：