Re: [求救]請問PCR products用restriction enzymeꐠ…
: 跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse
: 各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2
: 以上單位都是ul。但我的DNA濃度品質不一~OD從 40~800 ng/ul
: 使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2
: 50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的廠牌是Fermentas
: 它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA)
: water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2
PCR的condition似乎沒問題（畢竟你都跑出來了...XD）
但Restriction enzyme的濃度有點不對喔！
protocal的體積是20ul 你自己提升到25ul的話 buffer的量也要依比例做調整
: 因為考量到我的PCR products加10會切不完整，~所以才加5，但照我的想法
: 我的DNA量不算太少，切出來應該會很清楚，但不知為何拍出來照片都很淡
: 我一直找不出原因。
你指的很淡是切出來的產物對吧？
原因是
1.你的DNA已經先被稀釋了5X 但這不是最主要的原因...
2.主要的原因是DNA的亮度取決於"片段長度跟量" （簡單的說就是nucleotide的量）
片段越短所要達到相同亮度 需要的數量就要更多
你的PCR product被RE切成更小的兩個片段 當然兩片段的亮度就會下降啦！
如果想要讓RE產物變亮一點就多提高加入的PCR product的量
如果怕RE切的不完全 可以拉長作用時間（1-2hr）
前提是你用的酵素不會因時間太長而亂切XD
再者 建議你做RE reaction時 每隔20-30min做一次spin down跟輕彈的動作
把蒸到蓋子上的水氣離心回溶液裡 以維持正確的濃度
還有一招就是...
因為酵素會逐漸失活
所以在反應時間超過一半之後 再加一點點(0.2-0.5ul就夠了)酵素進去
如果你用的酵素很貴的話...我不建議你這樣做...
但如果要這樣做的話...
那記得不要讓你老闆知道...XD
以上 希望對你有幫助 祝實驗順利～
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