Re: [求救]請問PCR products用restriction enzymeꐠ…
※ 引述《calmato (Anita~)》之銘言：
: ※ 引述《albertwang (會思考的魚)》之銘言：
: 不好意思~因為我是第一次接觸分生~很多東西都是自己try
: 或找資料或問人~所以有很多東西~不知該怎麼問或該注意什麼
: ~所以真的很不好意思~遇到很多問題卻自己一直沒法解決 >"<
: 廠商給的information 是只有說 To make 100uM stock solution
: add 255 ul of buffer
: 我的working primer是從這裡面取10ul primer + 90 ul water
: 那我把我的所有try的條件po上來~但不知道這樣是不是您說的反應條件?
: 跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse
: 各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2
: 以上單位都是ul。但我的DNA濃度品質不一~OD從 40~800 ng/ul
: 使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2
: 50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的廠牌是Fermentas
: 它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA)
: water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2
: 因為考量到我的PCR products加10會切不完整，~所以才加5，但照我的想法
: 我的DNA量不算太少，切出來應該會很清楚，但不知為何拍出來照片都很淡
: 我一直找不出原因。
: 也想請問您剛說用酒精沉澱，是如何做呢?
: 以上很冗長，感謝您的指教!!
PCR完的product要clean up後測OD才準吧...不然你也只會測到一堆primer
如果直接拿去切...你所說的100bp以下也有可能是primer dimer
所以就是要先把primer 先去除後再考慮你說的問題
所以呢 應該有兩個方法
1.用PCR purification kit 去除primer buffer Tagpolymerase
因為會有loss 所以做PCR的時候可以多做幾管(clean up順便濃縮)
2.直接跑電泳 然後把你要的band切下來做Gel degestion分離出你要的片段
這方法會比第一個loss更多(取決於你切的膠量, kit品質)
只是可以更直接確定你純化出來的是你要的產物
之後的產物再拿去做你的PCR check應該會更有準確性
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