Re: [求救] 關於real-time PCR的問題
以個人最近操作相關實驗所遇到的問題
整理一下可能需要小心的部分
1.通常給RealTime PCR 使用的RNA sample會做DNase treatment的原因
多是為了避免genome DNA干擾..如果你的cDNA片段在genome DNA也有一模一樣的
利用SYBR green 或是TaqMen都會被測出來
這樣的讀值，就非單純因為RNA轉錄出來的cDNA所造成的
所以通常會有以下兩種方式排除genome DNA的干擾
A.RNA sample 利用DNase treatment....
B.primer design 跨過junction.....
也就是跨過一個intron..這樣也可以避免genome DNA的污染
EX:如下圖 == 代表 exon
-- 代表 intron
__ 代表 primer
5'__
========-----------------========
exon intron __ 3'
補充說明原理：RealtimePCR的產物通常都很短...
而genome DNA上的intron如果被PCR出來，常是好幾K或數百bp
以RealtimePCR常用的短時間anealing time 來說，不太PCR的出來
另 在Dissociation Curve中也會看到不同溫度的產物....
2.另外一種DNA污染，plasmid .....
如果要測定的A基因已在同一個實驗室中重複反覆的一直操作
只要primer設計時在ORF中......無論有無intron的設計
primer都會在含有A基因的plasmid中PCR出相同的產物
如果在抽RNA的操作上稍有不慎....很有可能發生類似的狀況....
或是 Realtime PCR 操作中時，都有可能發生
解決方式..
A:使用有filter的tipe操作RNA純化和Realtime PCR
B:RNA純化之後，利用DNase treatment...再進行RT轉錄
C:在Laminar Flow中操作Realtime PCR 避免plasmid 污染
D:在有plasmid 污染的狀況下，水或所有試劑 都要特別小心處理
3.RNA抽完之後，我通常會跑一片RNA gel確認一下RNA的品質
因為RNA 如果已經degrade了..跑膠是最容易看出品質的方式
OD值有時反而沒這樣的直覺性....
4.通常RNA取一定的量之後做RT......
Sample就以RNA當初所取的量為主，再取相同體積的cDNA來做實驗...
另 有時會有人為了確定RT 與 NoRT 的差異比較
而取相同量的RNA與已經RT過的cDNA做相對比較，來證明RT是在此次實驗中是成功的
Deta所呈現的數值是可信的..............
5.最後 你提到RT前為何要先在65度反應
主因是 RNA常有二級結構的問題
利用65將結構打開，以利之後RT的反應完整....
※ 引述《crazyrange (熱血羽球)》之銘言：
: 我在萃取RNA之後 沒有用DNase
: 結果我在測量RNA量的時候 我也同時去測量DNA的量
: 的確也偵測到了DNA的量 而且還不低
: 我想請問一下
: 在我抽取的RNA中還有DNA的話
: 對於我接下來要做的RT會有很大的影響嗎?
: 我是這樣想的
: RNA是單股 DNA是雙股
: 可是在跑RT的時候 加入的過程中DNA會分解成單股
: 而加入的primer是random primer
: 這樣的話在做RT的時候 DNA是不是也會被反轉錄?
: 那如果在萃取完RNA後加入DNase去反應
: 是否之後在測量RNA濃度的時候就會測不到DNA的存在?
: 在RT之後的cDNA需要測cDNA濃度嗎?
: 還是說因為在跑RT之前的RNA就已經是固定量(ug)
: 所以RT出來的cDNA可以不用測 不同sample可以直接用同量(ul)的template
: 去跑real-time PCR?
: 整個疑惑
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