Re: [求救] 關於real-time PCR的問題
我跑完RT之後
我試圖測量裡面的DNA濃度
我的作法是同樣sample分別加入A:1ug及B:2ug RNA template進行RT
結果出來之後我分別去測量裡面的DNA及RNA濃度
得到的結果為
DNA濃度 A260/280 RNA濃度 A260/280
A 1.9732ug/ul 1.83 1.5475ug/ul 1.87
B 2.0285ug/ul 1.83 1.6260ug/ul 1.89
讓我覺得疑惑的是
1.為什麼還測得到RNA,是因為原本的template嗎?可是我只加入1or2ug補到20ul中,
怎麼測出來的濃度這麼高.而RNA的濃度也沒有成兩倍比例,是因為pipette error?
2.測出來的DNA沒有呈現兩倍的差異,是因為其中含有dsDAN及cDNA嗎?
所以只有cDNA是變成兩倍而dsDNA沒有,所以才會造成total DNA不會呈現兩倍差?
3.如果有一組C他與B的條件相同只是不同sample,那麼同樣加入2ug進行RT之後,
出來的cDNA量是否是跟B一樣,因為一開始用同樣量的RNA?
4.還是說因為抽出來的RNA包含tRNA.mRNA.rRNA,而RT只有將mRNA轉成cDNA?
還是全部的RNA都會被轉成cDNA?
RT的條件是(kit的條件)
25度C 10分鐘
37度C 120分鐘
85度C 5秒鐘
我看paper上說做RT前會將RNA與primer混合,
然後在65度C反應10分鐘再放到冰上
接著在加入其他材料
然後才依照溫度與時間做RT反應(42度C 50分鐘;70度C 15分物鐘)
5.我的第 一個溫度是25度C的室溫
請問這會有麼差異嗎?
謝謝各位 幫我解決我的困惑
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◆ From: 59.120.7.114
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