Re: [求救] Western怪怪說

看板Biotech作者latte366 ( )時間18年前 (2008/02/20 23:57)推噓3(3推 0噓 2→)

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※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言： : > 想請教大家一些問題 >< : > 今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘都一片空白，就狠下心給他壓了3小時， : > 結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的 : > protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？對了連marker也變成白色的 : > 和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次 : > 壓沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色） : > 不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的 : 如果是壓了那麼久結果反白 : 而且除了預期的笨的以外還有很多額外的白色笨的 : 連媽可都有（我預期你用的媽可本來應該是不會被二抗認到的吧？） : 則我認為是你村死否完以後沒有補辣可好 : 所以一抗或二抗就黏到沒有蛋白質的地方了 : 當然考慮到你壓了那麼久 : 其實那根本可以看成只是合理程度的背景而已您是轉信的推文會看不到所以我就直接回文啦上面是不認識的人的問題在這裡替他感謝您提供意見 ^^ : > 借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考) : > 以下連結是壓片的結果 : > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 : > 問題一: : > 請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎? : 如上解 : 圖中黑色的笨的看起來很正常啊強度也比你的背景強很多 : 我覺得只要不壓那麼久問題就可以解決了這隻抗體那時第一次測我也恨我為什麼那時不從短時間開始壓就好.....Orz : > 方法: : > 壓片15min， loading:120ug total protein : > 一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)， : > (學長是說我一抗加太多了同學則是說我壓太久) : 看說明書 : 不過一般來講一抗加到 1:500, 除非真的是很鳥的一抗.... 要不然就是太濃了 : > 二抗用1:5000稀釋，1hr : 也滿濃的 : 抗體不是滴滴香醇意猶未盡越濃越好喔其實那時一抗選1:500還有個原因就是他的data sheet建議 1：100～1：500 我做完的隔一個星期同實驗室同學的用1:2000就抓的到了所以說加的量果然還是得實際自己做過才抓的準另外二抗的濃度就真的是我猜的了我同學用1:2000二抗（濃到炸了吧）backgroound並不會很黑也沒一堆雜band 我是覺得挺羅生門的但要我解釋我又說不出個所以然其實做實驗這樣不好應該是要序列稀釋後取幾個titer的量去看抓一個最好的condition 不過錯誤中學習也是一種機會教育啦（謎之聲老闆的錢就是這樣流掉的....T_T) : > 一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS : > 且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking : > transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 : > Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr : > 至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白 : > 怕她量太少所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz) : 改用血清作補辣可可能更好 : 對了你一抗二抗用什麼物種？ : 一抗是綿羊的話不適合用牛奶作補辣可喔 : 因為抗綿羊抗體的二抗也會認牛奶裡的什麼東西血清(指BSA嗎）有機會的話偷一館來試試雖然貴了點......T_T 一抗是 mouse monoclonal Ab (anti-neuregulin Ab) 二抗是 donkey anti mouse Ab-Hrp : > 問題二: : > 加入sample buffer後煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上請問各位怎麼做) : > 以上兩個問題 : 沒差 : 除非你是做超級脆弱的蛋白質或者是要看否死罘瑞累宣 : --- : 對不起我今天生病了 : 生了一種喜歡用中文拼寫英文的病............................ 沒關係我看的懂呵呵 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.93.52

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tsubasawolfy

02/21 00:05, , 1^F

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tsubasawolfy

02/21 00:06, , 2^F

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boblu

02/21 02:43, , 3^F

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