> ※ 引述《Nikio (工作有夠忙)》之銘言：
> 想請教大家一些問題 ><
> 今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時，
> 結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的
> protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的
> 和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次
> 壓沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色）
> 不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的
如果是壓了那麼久結果反白
而且除了預期的 笨的 以外 還有很多額外的白色 笨的
連 媽可 都有（我預期你用的 媽可 本來應該是不會被二抗認到的吧？）
則我認為是你 村死否 完以後沒有 補辣可 好
所以一抗或二抗就黏到沒有蛋白質的地方了
當然 考慮到你壓了那麼久
其實那根本可以看成只是合理程度的背景而已
> 借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考)
> 以下連結是壓片的結果
> http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0
> 問題一:
> 請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎?
如上解
圖中黑色的 笨的 看起來很正常啊 強度也比你的背景強很多
我覺得只要不壓那麼久問題就可以解決了
> 方法:
> 壓片15min， loading:120ug total protein
> 一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)，
> (學長是說我一抗加太多了 同學則是說我壓太久)
看說明書
不過一般來講一抗加到 1:500, 除非真的是很鳥的一抗.... 要不然就是太濃了
> 二抗用1:5000稀釋，1hr
也滿濃的
抗體不是滴滴香醇意猶未盡越濃越好喔
> 一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS
> 且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking
> transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式
> Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr
> 至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白
> 怕她量太少 所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz)
改用血清作 補辣可 可能更好
對了你一抗二抗用什麼物種？
一抗是綿羊的話 不適合用牛奶作 補辣可喔
因為抗綿羊抗體的二抗也會認牛奶裡的什麼東西
> 問題二:
> 加入sample buffer後 煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上 請問各位怎麼做)
> 以上兩個問題
沒差
除非你是做超級脆弱的蛋白質或者是要看 否死罘瑞累宣
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對不起我今天生病了
生了一種喜歡用中文拼寫英文的病............................
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莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
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※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: boblu.STUDENT.CWRU.Edu
推
02/21 11:24, , 1F
02/21 11:24, 1F
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