Re: [求救] Western怪怪說

看板Biotech作者 ( )時間18年前 (2008/02/20 21:49), 編輯推噓6(6推 0噓 37→)
留言43則, 4人參與, 最新討論串3/5 (看更多)
※ 引述《Nikio (工作有夠忙)》之銘言： 想請教大家一些問題 >< 今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時， 結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的 protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的 和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次壓 沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色） 不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的@@? =========我===========是===========分==========隔===========線=============== 吃掉一部份 ^^"" 借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考) 以下連結是壓片的結果 http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 問題一: 請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎? 方法: 壓片15min， loading:120ug total protein 一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)， (學長是說我一抗加太多了 同學則是說我壓太久) 二抗用1:5000稀釋，1hr 一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS 且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr 至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白 怕她量太少 所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz) 問題二: 加入sample buffer後 煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上 請問各位怎麼做) 以上兩個問題 希望有這方面經驗的前輩能給個建議 感恩 ^^ 圖片歡迎轉載 大家一起討論長知識 =========我===========是===========分==========隔===========線=============== -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.170
推
01/25 19:52,
曝光過度
01/25 19:52
推
01/25 22:06,
時效過完加再多也沒用喔
01/25 22:06
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01/25 22:06,
可以把ECL跟抗體洗掉重新來一次
01/25 22:06
推
01/25 22:45,
01/25 22:45
推
01/25 23:00,
白band通常是太強造成反白 不過壓久才出現 需要擔心是
01/25 23:00
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01/25 23:01,
是非專一性出現的band 不然應該一開始就壓得出來
01/25 23:01
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01/25 23:03,
專一性的band應該只會出現一條 短時間>黑 長時間>白
01/25 23:03
推
01/26 10:08,
壓片時間太久了 以秒為單位試試看 用個10秒20秒~~
01/26 10:08
-- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.93.52 ※ 編輯: latte366 來自: 140.116.93.52 (02/20 21:53)
推
02/20 22:13, , 1F
靠..1抗1:500就算了..還O/N..你1抗是怎麼來的?純度不好?
02/20 22:13, 1F
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2抗1:5000也有點多..買來的antibody 1抗1:3000 or 1:5000
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2抗1:10000甚至1:20000都可以..
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02/20 22:15, , 4F
而且protein還load滿多量的..你這樣的量
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說不定光是壓個10秒band都超黑的..= =
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1抗不用到O/N啦..跟二抗一樣1小時就好
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哈 其實我也覺得太多 這是有原因的 以下說明
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不過你壓5min沒東西..
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一開始用santacruze的抗體 loading 40ug protein跑不出來
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看錯..5min沒東西不是你的問題
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後來改loading 120ug 就有 可惜雜band太多
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改ABcam的monlonal clonal Ab後 其實也想過titer
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雜band多..你是抗什麼的?專一性不高摟
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要不要重測 或許不需要那麼濃 蛋白質也不用loading那麼多
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雜band多可能跟你1抗過多還有時間過久有關吧
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推
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唔 不是有針對膜蛋白的萃取方式?
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protein 40ug做不出可以提升一下量..或許真的很少很少
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只是因為一些因素 後來還是照原來condition跑
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b大可以請問您 那一條條白白的是因為一抗太濃嗎？
02/20 22:24, 19F
推
02/20 22:24, , 20F
我覺得你降低antibody量應該可以提升專一性
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白白的應該是太亮..曝光過久
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就你的圖看來真的抓很多莫名其妙的東西的感覺
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你壓片壓多久?
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02/20 22:26, , 24F
t大 膜蛋白的翠取方式 其實我最近還在看資料
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之前沒做過 所以不敢做 現在的方法是用前人的
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感謝您b大 我下次試著把一抗二抗降低titer
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02/20 22:28, , 27F
30min 不過 另一個同學 同一支Ab 一抗、二抗1:2000
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02/20 22:29, , 28F
出來的結果就很漂亮 沒有我的問題
02/20 22:29, 28F
推
02/20 22:30, , 29F
壓片時間也影響很大..除非量很少要不然基本上壓幾秒
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02/20 22:30, , 30F
頂多到幾分鐘應該結果都不錯
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02/20 22:30, , 31F
打錯 是15min
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02/20 22:31, , 32F
要不要試試壓30秒之類的短時間..說不定就可以了
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02/20 22:31, , 33F
那我懂了 明天再來試試 謝謝兩位 ^^
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02/20 22:32, , 34F
恩恩 OK 我下次試看看 謝謝您
02/20 22:32, 34F
推
02/20 22:38, , 35F
壓超過15min的我就會放棄重做..
02/20 22:38, 35F
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02/20 22:38, , 36F
平常就 3min當基準往前往後調時間 最多10min
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推
02/20 22:42, , 37F
用 dot blotting 作一次 control 就知道哪裡出問題了~
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02/20 22:44, , 38F
其實我一開始做 也是從2分鐘開始調時間 只是繳了很多次
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02/20 22:45, , 39F
白卷 就會想壓更久一點看看 那時只是想先看看有沒有band
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02/20 22:47, , 40F
確定抗體OK後 才想進一步調整加的量跟時間 等於是....
02/20 22:47, 40F
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02/20 22:48, , 41F
我在花錢先看有沒有 再來求好 至少有看到我要的東西了
02/20 22:48, 41F
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02/20 22:49, , 42F
只是會很好奇那個白白的條狀物是什麼 順便跟大家分享
02/20 22:49, 42F
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02/20 22:50, , 43F
"dot blotting"? 頭一次聽到 我去查一下先 感謝^^
02/20 22:50, 43F
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