Re: [求救] 做了好多遍的clone，就是接不上去，why?
※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言：
: ※ 引述《kutoushinji (所有人都跟我犯沖嗎?)》之銘言：
: : 酵素切位是我設計的
: : 一個是平頭的一個是sticky的
: : 好的，我今天試試看換新的buffer
: : 我們家都是分裝的，可能是我的buffer壞掉了
: clone的切位能不用blunt end就不要用blunt end
: 假如你的buffer沒問題的話
: 你可以試試讓他ligation更久一點
: 我試過4度C放個三天..效果還不錯
: 最快的方法還是重新設計一個primer改成兩端都是sticky end..
: 這樣也不一定要在做一次TA..你可以把這次的plasmid當作template
: 然後做PCR直接拿product去用..
: 總之有blunt end就是麻煩啦...
blunt end 沒有那麼難接啦
insert & vector處理好壞是關鍵
限制酶量及作用時間參考酵素說明書
兩種酵素是否可以一起切也是關鍵之一
NEB網站上有蠻多資料可以參考
如果需要挖膠純化 動作盡可能快不要在UV box上太久
ligation 室溫2小時效果就不錯
heat shock後加SOC比用LB 轉形率好很多
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◆ From: 140.112.74.19
推
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