Re: [求救] Cloning 的問題

看板Biotech作者cyken (Ken)時間16年前 (2008/01/22 00:18)推噓1(1推 0噓 5→)

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※ 引述《canongirl (變世上唯一不變)》之銘言： : 大家好，目前我手上有一個clone 要做 : 老師請我先去合兩條primers 有53mer : 序列(舉例)： primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3' : primer2：5'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...3' : 也就是兩條完全pair，因為這53mer其中包含我要clone的insert 另外有兩端各有BamHI : 的切位可以接在vector上請你仔細看一下, 你上面設計的primer根本無法正確地如你希望地 anneal 正確的primer應該要互為 reverse complement primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3' primer2：3'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...5' 若要設計兩端為 BamHI , 並不需要用到BamHI去切你可以設計成這樣 primer1：5'GATCCATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...G 3' primer2：3' GTAGCGCACTATACACGAGTATCGA...CCTAG 5' 接下的實驗步驟給你參考一下,這是我常用的方法: ** 方便起見 microM 表示為 uM , microliter表示為 uL ** 1. primer稀釋成 10 uM的濃度 2. PNK reaction: (用500uL或200uL的eppendorf) primer1 (10 uM) 1 uL primer1 (10 uM) 1 uL PNK buffer (10X) 1 uL ATP (10 mM) 1 uL T4 PNK (? units) 1 uL *隨廠牌不同,活性單位會有不同算法和濃度通常不會特別去精算用量,直接加 1 uL dd water 5 uL ---------------------------- Incubate at 37度C , 1 hour 3. PNK之後,直接拿去做anneal,最方便的方法是用PCR machine, 所以PNK的時候用500uL或200uL的 PCR eppendorf,就可以直接上機設定你的PCR machine: 95C,5min -> 65C,5min -> 45C,5min -> 25C,收 4. 切你的 vector DNA, 例如你這邊用的 BamHI, 只切一個enzyme的話,記得要再做 CIP,以免 self-ligation 然後run agarose gel純化 DNA 這一個步驟其實跟一般的cloning都一樣,有問題的話向實驗室學長姐或老師請教 5. Ligation : PNK並anneal之後的DNA不需要純化,可以直接拿來做ligation vector DNA ~100 nanogram annealed primer 1 uL ligase buffer xx uL T4 DNA ligase x uL dd water xx uL 這個步驟就跟一般的ligation一樣, 實際反應體積就看你的vector DNA濃度來調整 ligation的溫度和時間各家作法不一,用你習慣的方法去做就好 =================================== 以上獻醜了, 歡迎各位板友的批評與指教。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.169.106

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cyken

01/22 00:45, , 1^F

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cyken

01/22 00:47, , 2^F

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推

bluecsky

01/22 04:18, , 3^F

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