Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

看板Biotech作者lentivirus時間18年前 (2007/10/20 21:42)推噓5(5推 0噓 1→)

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其實做site direct mutagenesis方法還蠻多種的，這個方法還不錯用 1 3 (RE1)----> ----> RE1------------------X------------------RE2 <---- <----(RE2) 2 4 A: (RE1------------------X---) B: (---X-------------------RE2) C: (RE1------------------X-------------------RE2) 1st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 2, primer 3 及 primer 4 得product A 及 product B (template source: target plasmid) 要將product cut and purify 2st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 4 得 product A、B、C (template source: product of 1st PCR (1:1) 取product C--->purify, cut by RE1 and RE2 將target plasmid for SDR, cut RE1 and RE2 (取長段，短段為置換) Ligation---transformation--->colony identification by sequencing Note：RE1-------RE2的長度當然愈短愈好，一般大概三到五百bp RE1及RE2最好是unique site (避免cut vector) primer 2,3 design部分最好要變的點在中間，前後各延長10~15bp GC結尾，specificity較高以上我常用的方法，另外還可以用PCR的方法跑一整圈plasmid，然後用Dpn1 cut 再接，實驗室有人做，應該是ok 有需要再提供給大家好了...我也沒實際試過 ^^"" -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.217.31.60

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rickson

10/20 22:01, , 1^F

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rickson

10/20 22:02, , 2^F

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blence

10/20 22:18, , 3^F

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