Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
※裡面吃掉 methylated template 似乎也可以交給 DpnI, 如果沒有特殊菌株的話... )
: 是比較建議:
: 1. 確認 template 來源單一. 比如說拿來 PCR 的 template 重新畫開挑
: single colony 抽 plasmid 用來做為重新 PCR 的 template.
: 2. 確認實驗的目的, 烏鴉不清楚你要 clone 的 gene 為什麼要重新 PCR,
: 所以下面只是猜測... 如果說是因為 cutting site 的問題, 要做不一樣的
: cutting site 好進行 sub cloning, 那建議可以只 PCR 前面一小段,
: 然後接回去舊的 vector 後再整段剪下來去進行 sub clone...
: 3. 如果排除了烏鴉上面可能的猜測, 非得整段進行 PCR 不可,
: 那可以...
: 3A. 重新 PCR, 重新接, 瘋狂送 Sequence...
: 3B. 檢查之前送定序結果的東西在 mutant 附近有沒有 cutting site 可以
: 進行剪接, 看看那麼多 sample 之中有沒有可以用來互相彌補的.
: 如果為了老闆要拼業績, 這是可以與 3A 同步進行的.
: 3C. 不顧一切的去訂 primer, 用 site-directed mutation 的方法一個個改回來...
: 當然, 烏鴉也是比較不建議 3C 的...
我現在的想法是分段做pcr然後再接起來
畢竟越短的錯誤機率越低
可是還沒想到要怎麼分段做
兩個pcr片段可以直接接起來嗎？(先變成一個大的insert)甚至多個接成長片段
再一起接到vector中 感覺起來就算可行 efficiency也超低
瘋狂送 Sequence我會被砍死啦！
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.230.179.75
※ 編輯: mojimoji 來自: 61.230.179.75 (10/20 02:21)
推
10/20 13:16, , 1F
10/20 13:16, 1F
推
10/20 13:20, , 2F
10/20 13:20, 2F
討論串 (同標題文章)
完整討論串 (本文為第 2 之 6 篇)：