Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
全部打完了才想到, 就算下面都懶得看也沒關係,
這句比較重要:
Ligation 接起來的東西因為機率 所以量少,
因為量少所以需要馬上丟去 transform 給 E.coli 去放大...
然而 linear 的東西是不被 E.coli 接受的.
所以... PCR product + PCR product ligation 的放大...
****
晚上又失眠, 火氣有點大一個不小心就把自己的東西給砍了...
好吧, 那時候烏鴉想的是...
烏鴉是猜啦, 大概是類似這樣子:
----|---------------|----- pUC18
EcoRI (target) PstI
好了, 上面那是別人給你的, 或許是某個 cDNA clone, 然後老闆想研究這東西.
於是乎想改接到 pcDNA3.1 之類的裡面, 只是 pcDNA3.1 你想接的位置剛好不是
EcoRI 跟 PstI, 所以你想要用 PCR 方式製作切位, 好方便接到 pcDNA3.1 裡面.
( 我都亂舉的, 有沒有那些 cutting site 我懶得去查 =____=" )
^^^^^^^^^^
分段 PCR 的意思在這邊就是說...
NotI XhoI
----|---------|-------------|---------|-----
EcoRI PstI
|<-----------(target)---------->|
比如說你要 PCR 的東西裡面有兩個 unique cutting site:
NotI 與 XhoI 很幸運的就在開頭跟結尾附近.
那就這樣子啦...
__
\-- <- primer #1 with HindIII cutting site
----|---------|-------------------------------
EcoRI ---- <- primer #2
Primer #2 離 NotI 遠一點會比較好, 因為到時候要切,
沒留足夠的長度 enzyme 會不好切; 但是太遠也沒必要.
這樣子下去就會得到:
HindIII NotI
---|---------|----
的小片段; 然後同樣的 primer #3 primer 4# 可以去弄出尾巴的小片段.
不過當然不是三個片段切一切拿去做 ligation...
把三個片段成功 ligation 起來的運氣留著買樂透的時候用比較實際.
扯歪了, 找個類似這樣子的 vector 當中間人:
HindIII (與 EcoRI 不重疊)
---|---|--- // ---|---
EcoRI XhoI 或 PstI
先把你原本有的東西用 EcoRI 跟後面兩個挑一個的位置接近去,
( 或 XhoI, 不重要, 反正多的往後
EcoRI NotI PstI 都要除掉. 後面假設挑了 PstI )
----------|---|-----|---------------|--------------
HindIII
-- plasmid -->|<----- target ------>|<-- plasmid --
然後切掉要置換的, 純化, 變成..
HindIII PstI NotI
|------- // -------|--------------|
|<---------------->|<------------>|
plasmid DNA 去頭target
呼... 好了, 可以跟前面提到 PCR 出來的小開頭片段相接了...
這樣子就換好頭了, 同樣的可以把 primer #3 #4 PCR 的尾巴也換進去,
最後, 就會達成換頭的目的, 切下來在接近去你真正想要的 vector 裡面...
其實不是什麼大難想法, 只是 BBS 不好畫圖(圓形) + 烏鴉表達能力不好罷了...
希望烏鴉寫的東西對你有幫助.
對了, 在最後面突然就很想寫...
烏鴉是這樣子想的...
年齡跟老不老鳥是沒什麼的.
老鳥, 某些實驗你做的很好, 沒什麼了不起,
只不過是你比我早接觸, 碰的次數比我多, 這很正常.
要自己留招就算了, 不需要你的 " 哎喲, 連這都不會, 回去翻課本吧 "
要也請給我是哪本課本跟頁數.
年齡, 就算你比我年輕, 以前某方面實驗你做的比我多,
那你的身上自然有我可以學習的地方, 跟你學沒什麼不好;
即使只是學些實驗之外的巧思也是很好的.
重要的是你有沒有在思考, 有沒有想要更好.
知道的, 有空的: 歡迎請說.
不想幫也沒關係, 但冷嘲熱諷這類即使只是表情也就都免了.
在你看來 " 基本 " 的東西, 對別人不一定基本.
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