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討論串[方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

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Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

推噓5(5推 )留言6則，0人參與作者lentivirus時間18年前 (2007/10/20 21:42)資訊

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其實做site direct mutagenesis方法還蠻多種的，. 這個方法還不錯用. 1 3. (RE1)----> ---->. RE1------------------X------------------RE2. <---- <----(RE2). 2 4. A: (RE1------

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Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

推噓2(2推 )留言2則，0人參與作者U0 (幽靈歡茄)時間18年前 (2007/10/20 18:42)資訊

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同病相憐. 也曾被類似的問題給阻礙. 那時候有看到一方法. 可是自己還沒實際做過. 因為後來重抽RNA多送幾個clone後問題就解決了. 希望對大家有幫助. http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/21/e174. 再打算做之前. 我有先問

Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

推噓5(5推 )留言7則，0人參與作者HIbaby (嗨北鼻)時間18年前 (2007/10/20 10:00)資訊

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看到這一大串討論. 提出我的做法. 1. 請使用可以proof reading的polymerase來作. 2. 如果是從A質體換到B質體儘可能用切的. 如果沒有適合的切位. 我會想辦法從 A 先換到適合的 C 在從C 接回B. 3. 萬一沒有template來源也就是都要從 cDNA來增幅

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Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

推噓3(3推 )留言4則，0人參與作者Crow22312 (烏鴉)時間18年前 (2007/10/20 05:44)資訊

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全部打完了才想到, 就算下面都懶得看也沒關係,. 這句比較重要:. Ligation 接起來的東西因為機率所以量少,. 因為量少所以需要馬上丟去 transform 給 E.coli 去放大.... 然而 linear 的東西是不被 E.coli 接受的.. 所以... PCR product +

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Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?

推噓2(2推 )留言2則，0人參與作者mojimoji時間18年前 (2007/10/20 02:15)資訊

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※裡面吃掉 methylated template 似乎也可以交給 DpnI, 如果沒有特殊菌株的話... )我現在的想法是分段做pcr然後再接起來. 畢竟越短的錯誤機率越低. 可是還沒想到要怎麼分段做. 兩個pcr片段可以直接接起來嗎？(先變成一個大的insert)甚至多個接成長片段. 再一起接到

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