Re: [問題] 請問ligation的一些問題
※ 引述《dreamlife.bbs@bbs.sa.ncyu.edu.tw (我是廢渣)》之銘言：
: 這邊我是用NanoDrop去測的
: 也是分光光度計的一種
: 測出來的值就是怎麼高
: 所以我很懷疑他是假的
: 對了 我只用了0.5ul的酵素去切
: 跑膠 只出現一條band
: 此部分嘛
: 因為本實驗室的人都懷疑純化效果不好
: 你也看到了 我拿了果此多的dna量去做
: 所以依column的建議50ul的效果最好
: 所以我用兩管 共是100ul
: 最後transformation前來個大濃縮
: 很明顯 是打錯了
: 是5ng/ul
: 我的估計指的是跑膠估計
: 後來有去測分光光度計上面那台
: 濃度是3ng/ul
: 所以效率明顯不好
: 真怪
如果你認為一開始的DNA濃度就有錯誤
那也不能從最後的結果就認為效率不好
假設一開始有180ug的DNA 絕對不可能以0.5ul的enzyme切好
我自己切20ug 20U/ul的限制酵素就要加到4ul 才能切完全
因為限制酵素會隨著時間及存放狀態(甚至一直放-20也一樣)而下降
就算是剛買來的 我也不會真的以1ug DNA對1U的酵素去切
誰知道這批酵素是多久以前做好的 在運送的過程有沒有缺失
所以建議你還是把一開始的DNA濃度真實測量清楚 再來談回收率
如果你覺得那台機器測出來的值不可靠 那就換一台測
甚至只採跑膠定量的濃度去相信(我的DNA量都只靠這個測 到目前也沒有出過問題)
另外 做ligation的片段在精不在多 只要DNA夠正確夠純
vector+insert只要50ng(個人習慣是30ng) 就可以成功ligate
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.133.24
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容：
完整討論串 (本文為第 9 之 9 篇)：